Estirpes de Streptococcus pyogenes a partir de Infecções Invasivas Graves ligam células HEp2 e HaCaT mais avidamente do que estirpes de infecções não complicadas

Streptococcus pyogenes (grupo A estreptococo ) é um agente etiológico para diversas doenças humanas, incluindo faringite, pioderma, e doenças invasivas graves. Além disso, o patógeno está associado a sequelas potencialmente fatais, tais como glomerulonefrite pós-treptocócica e febre reumática aguda. No Território Norte (NT) da Austrália, a incidência de febre reumática aguda é muito alta entre a população indígena (3), apesar da baixa taxa de isolamento da garganta do GAS. Além disso, o pioderma por infecção por GAS é extremamente comum e a glomerulonefrite pós-treptocócica é endêmica em muitas comunidades aborígines remotas (4, 7). Enquanto o transporte assintomático da garganta é frequentemente o reservatório relatado para cepas associadas à doença invasiva (5), em populações onde o impetigo é endêmico, como nas comunidades aborígines na TN, o reservatório primário é a pele. Independentemente de qual tecido é o local primário da infecção, o primeiro evento que o patógeno precisa atingir é a aderência às células hospedeiras. O genoma de S. pyogenes codifica numerosos genes que poderiam ser considerados como codificadores de aderências. Estes genes são altamente regulados, e as estirpes individuais não têm o potencial genético para codificar todas estas proteínas. As adesinas incluem a proteína M (uma molécula anti-fagocítica), cápsula, e proteínas de ligação à fibronectina. Existem muitas proteínas diferentes de ligação à fibronectina, tais como SfbI (8, 12), PrtF2 (9, 10), Fbp54 (2), e SfbII (11). A capacidade de adesão de uma estirpe individual pode variar dependendo do repertório de genes para as aderências que a estirpe possui e seu nível de expressão. Isto, por sua vez, pode refletir as diferenças na capacidade de colonizar e infectar persistentemente diferentes sítios teciduais. Um corolário disto é que os isolados de diferentes sítios teciduais podem apresentar diferenças na capacidade de aderência. Para testar isto, nós determinamos a extensão da ligação dos isolados de GAS da pele, garganta e sangue às linhas celulares HEp2 e HaCaT, representando células epiteliais laríngeas humanas e queratinócitos, respectivamente.

GAS isolados do NT foram coletados entre 1990 e 2002. As 72 linhagens analisadas neste estudo foram isoladas de sangue (n = 26), pele (n = 22), e garganta (n = 24) (Tabela 1). Os isolados de sangue eram de doenças graves e as demais cepas eram de infecções não complicadas. Os isolados foram do tipo Vir, conforme descrito anteriormente (6). A tipagem de vírus envolve o polimorfismo do comprimento do fragmento de restrição do mga regulon, que inclui o gene da proteína M altamente variável. Para garantir a inclusão de cepas epidemiologicamente não relacionadas, foi incluído um isolado representativo de cada tipo de Vir. As culturas foram cultivadas durante a noite a 37°C em um agitador orbital até a fase estacionária no caldo Todd-Hewitt (Oxoid, Basingstoke, Reino Unido) suplementado com 1% de extrato de levedura. Para preparar o inóculo de GAS para ensaios de aderência, as culturas foram centrifugadas durante a noite, e os pellets foram lavados em tampão fosfato salino (PBS; Life Technologies Gibco BRL, New York, N.Y.) e ressuspendidos em meio RPMI 1640 sem soro e sem antibióticos (Life Technologies) até uma densidade óptica a 600 nm de 0,05. Isto representa aproximadamente 1 × 107 a 1,5 × 107 bactérias por ml.

Células epiteliais laríngeas humanas (HEp2) foram mantidas em meio RPMI 1640 suplementado com 10% de soro fetal de bezerro (Life Technologies), 1% de Fungizona (Life Technologies), 20 μg de vancomicina HCl (David Bull Laboratories, Sydney, Austrália) por ml, e 100 μg de sulfato de estreptomicina (Sigma, St. Louis, Mo.) por ml. Os queratinócitos da pele humana adulta (células HaCaT) foram mantidos no meio Eagle modificado da Dulbecco (Life Technologies) suplementado com 10% de soro fetal de bezerro ativado pelo calor. Para ensaios de aderência, ∼105 células/ml foram semeadas em lamelas de vidro de 12 mm de diâmetro no fundo de placas de cultura de tecido de 24 poços (Nunc, Roskilde, Dinamarca). Após o crescimento noturno a 37°C em atmosfera de 5% de CO2, as células foram lavadas com PBS (pH 7,4) e inoculadas com 500 μl do inóculo de GAS. Depois de 2 h de incubação a 37°C, as lamelas foram lavadas cinco vezes adicionando 1 ml de PBS a cada poço, e depois de uma mistura suave, a solução de lavagem foi removida por aspiração. Após a remoção das bactérias não aderentes, as células hospedeiras e as bactérias aderentes foram fixadas com 95% de metanol e secas ao ar. Após a fixação a quente, as lamelas foram colocadas em lâminas e Gram coradas para visualização sob imersão em óleo. Em cada experimento, células em vários campos aleatórios foram analisadas e a fixação foi expressa como o número médio de cadeias de GAS por célula. Todos os ensaios foram realizados em duplicado, e a média de ligação foi determinada para cada estirpe. Todas as análises estatísticas foram realizadas com o programa Stata Statistics/Data Analysis versão 7.0 (Stata Corporation, College Station, Tex.). Os dados foram analisados com testes t.

GAS cepas aderidas a ambos os tipos de células, e o grau de ligação variou de cepa para cepa (Tabela 1). Houve boa correlação entre experimentos independentes com 20 isolados repetidos em dois intervalos de tempo (dados não mostrados), sugerindo que a avidez de ligação é reprodutível e específica da estirpe. Em geral, a ligação de GAS às células HaCaT é maior do que às células HEp2 (P < 0,05). Quando os dados da Tabela 1 foram separados com base no local de isolamento do tecido, uma média de 270 cadeias de cepas de GAS a partir do sangue ligado a 50 células HaCaT (Fig. 1). Em contraste, a pele e a garganta isolam em média apenas 169 e 178 cadeias por 50 células HaCaT, respectivamente. Estas diferenças são estatisticamente significativas (P = 0,0044 e 0,0063, respectivamente). Curiosamente, para as células HEp2, as diferenças são menos pronunciadas e não estatisticamente significativas. Entretanto, quando os dados foram reanalisados com base em infecções invasivas versus não complicadas pela combinação de dados para a pele e isolados de garganta, diferenças significativas entre as duas categorias foram encontradas em ambas as linhas celulares (P = 0,0011 para HaCaT; P = 0,0238 para HEp2).

Trabalhos anteriores deste laboratório mostraram que muitas cepas de S. pyogenes comumente circulantes poderiam causar doença invasiva com a pele como o local primário da infecção (1). Estas observações são consistentes com os achados atuais de maior avidez das cepas de GAS do NT para HaCaT do que as linhas de células HEp2 e isolados de sangue sendo capazes de se ligar em maior número do que os isolados de infecções não complicadas. Possíveis explicações para a alta propensão de aderência dos isolados de sangue de S. pyogenes incluem diferenças genotípicas e fenotípicas entre isolados de fontes de doenças invasivas e não-invasivas. Outros estudos são necessários para definir a natureza desta avidez de ligação e para determinar se ela é consistente dentro das populações clonais.