Conteúdo e propriedades do fluido intracelular

Este capítulo é vagamente relevante para a Seção E(iv) do Programa de Estudos Primário CICM 2017, que espera que o candidato ao exame “descreva a composição …do fluido intracelular”. Como esta é a seção sobre fisiologia celular, o foco aqui será principalmente o nível micro de organização, e toda a discussão sobre o compartimento do fluido intracelular será deixada para a seção de Fluidos Corporais.

O facto de os examinadores universitários nunca terem focado o seu Olho neste tópico empresta um ar quase libertador de inutilidade à discussão do mesmo, uma vez que tanto os candidatos ao exame como o autor estão agradavelmente conscientes de que cada um está a desperdiçar o tempo do outro. Em vez de imbuir-se de ciência dura e memorizar fatos examináveis aqui, pode-se facilmente ler por razões puramente medievais, ou saltar adiante para tópicos que atraem mais notas.

Em resumo:

Quais são os recursos revisados por pares válidos para este tópico? Infelizmente, eles são numerosos. Quando se usa um motor de busca ou a secção de índice de um livro de texto para procurar “fluido intracelular”, há inevitavelmente uma resposta, uma série de entradas ou páginas ou slides powerpoint que – embora todos vagamente semelhantes no seu conteúdo – diferem nos seus valores citados, e não oferecem nada na forma de referências. Muitos não oferecem qualquer informação útil. Por exemplo, voltando aos livros oficiais da faculdade sobre este assunto (Ganong, p.2 da 23ª edição, e Guyton & Hall, p. 4 da 13ª edição), encontramos concentrações de eletrólitos citosólicos sendo discutidas usando termos como “grandes quantidades”. Mesmo fora da bibliografia oficial, senão ofertas sólidas como Biologia Molecular da Célula não têm respostas diretas. Eles não conseguem sequer concordar no que chamar (citosol? Protoplasma? Primordialschlauch?)

Felizmente, ainda há cientistas por aí que publicam sobre este tópico. Provavelmente o melhor artigo é a peça de 1999 de Katherine Luby-Phelps, que basicamente contém tudo o que você poderia precisar para responder a quaisquer hipotéticos SAQs futuros sobre este tópico. Outro excelente artigo que trata principalmente das propriedades do material intracelular é o pequeno artigo de Richard P. Sear (2005). Se alguém é verdadeiramente louco e tem os recursos de tempo de um especialista permanentemente contratado (ou seja, sem obrigação urgente de realmente realizar qualquer trabalho útil) pode, em vez disso, explorar In Search of the Physical Basis of Life (1984) de Gilbert Ling, um livro de 800 páginas escrito por um homem cujas publicações sobre fisiologia celular se estendem até os anos 50.

Volume de um espaço intracelular

Quão grande é uma célula? Obviamente, isso depende da célula. Um bom exemplo de um outlier é o oócito Xenopus, o ovo de um sapo africano com garras, que tem 1mm de diâmetro. Quando se fala em humanos, geralmente se refere ao fluido intracelular como se fosse um balde relativamente homogêneo, mas na verdade esse compartimento de fluido é composto de algo como 1014 minúsculos compartimentos, cada um com um volume e composição ligeiramente diferentes.

A heterogeneidade de todos esses volumes está bem resumida neste capítulo da base de dados BioNumbers, onde todo tipo de informação meticulosamente referenciada pode ser encontrada. Ela é reproduzida aqui com modificações mínimas, no caso dos servidores de Harvard alguma vez falharem.

Volumes de células mamíferas

Célula tipo	Volume (μm3, ou femtolitros)	Volume (picolitros)	Referência
Célula de esperma	30	0.03	Gilmore et al, 1995
Erythrocyte	100	0.1	Ballas et al, 1987
Linfocito	130	0.13	Schmid-Schonbein et al, 1980
Neutrophil	300	0.3	Rosengren et al, 1994
Pancreática β-cell	1.000	1.0	Finegood et al, 1995
Enterocito	1.400	1,4	Wiśniewski et al, 2012
Fibroblasto	2.000	2.0	Mitsui et al, 1976
Tumor cervical (HeLa)	3.000	3,0	Zhao et al, 2008
Célula (ouvido)	4.000	4.0	Géléoc et al, 1999
Osteoblasto	4.000	4,0	Beck et al, 2011
Macrófago alveolar	5.000	5.0	Krombach et al, 1997
Cardiomyocyte	15.000	15,0	Calvillo et al, 2003
Megacaryocyte	30.000	30.0	Harker et al, 2000
Adipócitos	60.000	60.0	Livingston et al, 1984
Oocyte	4.000.000	4000	Goyanes et al, 1990

Então, é uma gama bastante ampla. Além disso, obviamente nem todo o conteúdo da célula vai ser ocupado por “fluido intracelular”, independentemente da sua definição desse termo. Por exemplo, para os fins deste capítulo, a definição de fluido intracelular será “conteúdos intracelulares que não são organelas”, simplesmente porque as organelas são discutidas em outro capítulo. Do que estamos falando, nesse caso, é da “substância cinzenta, viscosa, viscosa, semitransparente e semifluida” que ocupa o espaço intracelular entre outras estruturas (Harvey, 1937).

Dependente do tipo de célula que você estiver olhando, esse espaço pode ser uma proporção muito pequena do volume total. Por exemplo, no adipócito omental acima, daqueles 60 picolitros de volume total, a grande maioria será ocupada por gordura sem água. Isto pode ser comprovado experimentalmente: DiGirolamo & Owens (1976) conseguiu calcular que o volume de água nos adipócitos de rato era cerca de 5-7% do volume total, ou seja, 1,5-2 picolitros.

Em resumo, estamos a olhar para um volume muito pequeno. Porque é que isso importa? Bem… O líquido interno da célula 1-2 picolitros de volume líquido é o volume de distribuição de substâncias solúveis. As moléculas dessas substâncias, portanto, têm uma distância muito curta a percorrer antes de se encontrarem umas com as outras. O efeito é aumentar a taxa de reacções, o que é útil porque a quantidade total de moléculas reagentes para um volume tão pequeno é, por necessidade, pequena. Para pegar um exemplo da Luby-Phelps (2000), se uma célula tem um conteúdo total de 1 nanomole de uma proteína, isso significa que há apenas 1000 cópias dessa proteína presentes na célula. Felizmente, com um volume tão pequeno a atravessar, uma molécula de ligação, mesmo de baixa afinidade, seria capaz de esfregar e adsorver a maioria do substrato disponível.

Conteúdo proteico do fluido intracelular

Ok, portanto o volume é pequeno. Que macromoléculas estão nele, e quantas delas? Alice B. Fulton (1982) ponderou sobre isso com provavelmente a resposta mais lúcida da literatura publicada. Basicamente, o conteúdo proteico das células está na faixa de 17 a 35% em peso, com a maioria dos autores caindo na faixa de 20-30g/100ml. Fulton cita textos antigos (Loewy et al, 1969) para dar os seguintes valores:

• Células musculares: 23% de proteína por peso
• Erythrocytes: 35% de proteína por peso
• Muitas outras células: 17% a 26% de proteína por peso

As medições são geralmente feitas por medições de índice de refração, que é uma técnica que normalmente não discrimina entre proteínas estruturais (por exemplo, aquelas das quais o citoesqueleto e as organelas são compostas) e proteínas solúveis que compõem o resto da gosma.

Então, qual é o objetivo desta discussão? Bem… Esta concentração de proteínas é bastante elevada. Ela está acima da concentração geralmente aceita de grandes polímeros, o que afetaria a difusão de outros polímeros semelhantes, ou seja, a floresta é muito densa. Chang et al (1987) produziram um modelo matemático que prevê que para polímeros a partir de 50kDa, esse limite de difusão é de cerca de 130g/L, ou seja, mais do que isso e outros polímeros não serão capazes de se difundir facilmente através da solução. Claro, eles estavam usando poliestireno dissolvido em benzeno, mas o fato permanece. Para comparação, quando se cristaliza completamente uma proteína, acaba-se com um “sólido” que é apenas 40% de proteína em peso

Em resumo, as proteínas no fluido intracelular são embaladas tão apertadas que o citosol tem de ser descrito como uma “solução apinhada”. O diagrama cartoonish aqui (originalmente publicado pela Goodsell em 1993, e posteriormente reproduzido por praticamente qualquer pessoa que já tenha escrito sobre o citosol) demonstra visualmente o quanto esses corpos estão bem embalados. O desenho foi aproximado, usando tamanhos e formas conhecidas de moléculas/microscópio eletrônico, mas fotos tiradas através do SEM (por exemplo, por Bridgman & Reese, 1984) demonstram que ele representa corretamente a microestrutura bagunçada do citosol. Olhando para os oócitos de Xenopus com uma ampliação de ~ 80.000, uma floresta densa de filamentos e grânulos torna-se aparente. A imagem aqui (uma parte da sua Figura 6) foi realmente limpa um pouco por lise celular e lavagem com detergente, para remover alguma da carga proteica que de outra forma obscurecia a estrutura mais fina. As setas estão apontando para os filamentos Y e T-junctions.

Sem a preparação do detergente, todo o material granular fino embalado entre estes filamentos torna-se visível. A imagem agora se assemelha ao ruído branco (mesmos autores).

Claramente, a difusão através desta espessura não vai ser normal. Solutos menores (por exemplo, seus íons sódio e potássio) têm que navegar ao redor desses enormes obstáculos, tomando a rota cênica em direção um ao outro. Do ponto de vista prático, isto deve significar que qualquer reacção que dependa da taxa de difusão vai ser mais lenta. Se as moléculas demoram uma eternidade a chegar umas às outras, certamente a taxa líquida da sua interacção deve ser reduzida. Contudo, não vemos isto.

Que propriedades químicas vemos, com esta sopa proteica altamente saturada? Allen P. Minton (2006) resumiu anos de pesquisa (principalmente a sua própria) numa tabela do artigo acima referido. Está resumido aqui:

• Afinidade de ligação de macromoléculas de outro modo diluídas umas para as outras
• A aceleração de associações proteicas, por exemplo. auto-montagem
• Desaceleração de reacções de difusão limitada e associações proteicas
• Estabilização de proteínas contra desnaturação térmica

Em resumo, a aglomeração força as proteínas a dobrarem-se e a interagirem, o que produz configurações complexas que de outra forma seriam impossíveis numa solução diluída. Por exemplo, Wilf & Minton em 1981 descobriu que moléculas diluídas de mioglobina em solução têm pouco interesse umas nas outras, mas a adição de uma solução a 10% de (qualquer!) outra proteína faz com que a mioglobina se reúna espontaneamente em dímeros.

Propriedades de água intracelular

Pequeno em uma proteína cristalizada, apenas 40% da massa é proteína real. O resto é solvente que ocupa os espaços entre as moléculas de proteína embaladas (não são exatamente retângulos, e não se empilham ordenadamente). Quando o solvente é água, metade dela acaba sendo adsorvida na superfície da proteína, mas o resto ainda pode ser visto como água líquida normal. Nesta fina película, os íons da água intracelular são dissolvidos.

Claramente, com a água adsorvida, as coisas são ligeiramente diferentes. Por exemplo, as propriedades solventes desta água não vão ser exactamente as mesmas que as da água “livre”. Por exemplo, provavelmente terá uma actividade química reduzida. Como seria de esperar, o estado “ordenado” da água lhe dá várias propriedades coligativas incomuns – por exemplo, Foster et al (1976) descobriram que seu ponto de congelamento está deprimido. Além disso, haverá bolsas de citosol com maior atividade (ao redor das estruturas proteicas hidrofílicas) e menor atividade (ao redor das hidrofóbicas).

Quanta da água é mantida neste estado cativo pelas proteínas? Isso é um pouco difícil de dizer. Experiências de Ling et al (1993) sugerem que dentro das células, a maior parte da água é “ordenada” desta forma, mas a maior parte das experiências que relatam este assunto são um pouco afetadas pelo fato de que as células vivas brutas que estão usando têm várias respostas homeostáticas às condições experimentais que confundem os achados.

De um modo geral, as pessoas tentam estabelecer esta resposta por células osmoticamente desidratadas. Aplicam uma pressão osmótica, raciocinam, e toda a água “móvel” deve sair da célula. Então você mede o conteúdo de água da célula, e tudo que sobrar deve estar “imóvel”, estacionado na superfície das moléculas de proteína e incapaz de migrar em resposta à pressão osmótica. Cameron et al (1997) apresentam o gráfico (roubado sem vergonha e exibido aqui, à esquerda) onde o conteúdo de água das células restantes é traçado contra um eixo x de pressão osmótica crescente. A linha de pressão vs. água remanescente, quando extrapolada a partir de evidência experimental e estendida para uma pressão osmótica “infinita”, acabou cruzando o eixo y em algum ponto não nulo. Dependendo de quais células você estava usando, isso acabou ficando entre 30-90% do conteúdo total de água.

Na verdade, parece que essa água adsorvida nas proteínas é a água essencial nas células, e toda a água “livre” é um lastro inútil. Clegg (1981), reidratando algumas células secas de camarão em salmoura, descobriu que a atividade metabólica retomou e era relativamente normal quando as células foram restauradas com cerca de 35% de água por peso, ou seja, cerca de tanto quanto se espera que “hidrate” todas as macromoléculas. Nesses camarões, quase certamente não havia água livre de “fase de massa”. Claro, eles não estavam tentando reproduzir ou sintetizar RNA (isso requereu hidratação até 70-80%) mas a síntese deles de aminoácidos e troca de gás continuou relativamente normalmente. Isto faz ainda mais notável o fato que quando medido objetivamente, esta sopa proteica espessa 20-30% tem uma viscosidade que se assemelha muito com água normal (Luby-Phelps, 1994)

Fuído intracelular pH

Carter (1972) publicou um artigo altamente influente sobre isto, que é frequentemente citado em livros de fisiologia humana, embora o autor utilizasse músculos do craca gigante (Balanus nubilus) que suspendeu em algo chamado “solução de craca Ringer”, uma salmoura com 450 mmol/L de sódio e 518 mmol/L de cloreto nela contida. Dificilmente se pode ler com algum nível de respeito pela generalidade humana de tais dados, mas se se fizer isso se descobriria a descoberta mais importante: que o pH nas células está tão compartimentado que diferentes regiões do citosol têm valores de pH muito diferentes, numa faixa de 6,0 a 7,5.

Concentrações de eletrólitos intracelulares

Geralmente, todos os livros didáticos, quando questionados sobre a concentração de eletrólitos no fluido intracelular, produzirão um Gamblegram como este (desviado de Ling, 1984, sem permissão de sua propriedade ou de sua editora).

Este diagrama aqui não é referido no livro de Ling, mas pode-se argumentar que não precisa ser, considerando que Ling fez praticamente todo o trabalho pioneiro na determinação do comportamento dos solutos intracelulares. Especificamente, nos anos 60, ele e Ochsenfeld determinaram que este potássio (e todos os outros eletrólitos do citosol) geralmente não está presente de forma livre, mas sim adsorvido nas estruturas macromoleculares.

Os investigadores desafiaram as células com isótopos radiolabelados e descobriram que isso teve pouco efeito no deslocamento dos eletrólitos já presentes, o que teria sido esperado se eles tivessem sido distribuídos livremente. Os eletrólitos intracelulares estão largamente presentes em complexos com macromoléculas e são muito menos móveis do que se poderia esperar de um modelo de célula onde todo o conteúdo existe em um saco aquoso homogêneo. Os mesmos autores (Ling & Ochsenfeld, 1973) confirmaram mais tarde que a mobilidade do potássio do compartimento intracelular para o extracelular era aproximadamente um oitavo do que se poderia esperar de uma simples difusão em solução livre. O músculo sapo morto vazou potássio um pouco mais rapidamente (a taxa de difusão foi reduzida em apenas 25% em relação ao esperado), como bombas alimentadas por ATP pararam de funcionar e a estrutura proteica se tornou desorganizada.

Então, vamos concordar que esses íons não são dissolvidos em um lago de água intracelular livre, mas sim ligados em complexos. Isso ainda não responde à pergunta: quanto do que está lá dentro? Acontece que isso é relativamente fácil de responder. Muito mais fácil, na verdade, do que qualquer das outras questões levantadas até agora neste capítulo. Basta tomar o citosol, congelá-lo e depois medir a composição elementar da massa seca. Mason et al (1981) fizeram exatamente isso para algumas células tubulares renais, pré e pós-isquêmicas. Seus achados são reproduzidos abaixo, tanto na forma da tabela original de 1981 como de um belo Gamblegram brilhante:

Como se pode ver pelas flutuações selvagens da concentração de potássio após mesmo 20 minutos de isquemia, a composição electrolítica das células é muito mais fluida do que a do fluido extracelular (onde uma mudança de 20mmol na concentração de qualquer electrólito seria mal tolerada, a um nível de sobrevivência do organismo existencial). Além disso, cada linhagem celular terá uma concentração de íon intracelular ligeiramente diferente. Isto dá origem à imprecisão dos valores intracelulares do eletrólito discutidos nos livros didáticos, e sua relutância geral em citar qualquer número. Praticamente qualquer número que você citar estará errado. Por exemplo, os túbulos distais de Mason tinham 11mmol/L de sódio em seu citosol, mas Poole-Wilson (1975) encontrou cerca de 44mmol/L em miócitos ventriculares esquerdos e 20mmol/L no quadríceps esquerdo. Alam et al (1977) dão valores de cerca de 25mmol/L para o sódio e 145mmol/L para o potássio em algumas células hepáticas em falência. Em resumo, o ambiente confuso e imprevisível de qualquer célula torna difícil a citação de números específicos.