- Dois tipos de modelos descrevendo a cinética enzimática: Os modelos sQ e tQ
- As estimativas com o modelo tQ são imparciais para qualquer combinação de concentrações de enzimas e substratos
- A estimação simultânea de k cat e K M sofre da falta de identificabilidade
- Dados combinados de diferentes experimentos permitem uma estimativa precisa e precisa com o modelo tQ
- Desenho otimizado dos experimentos para estimação precisa e eficiente com o modelo tQ
Dois tipos de modelos descrevendo a cinética enzimática: Os modelos sQ e tQ
Uma reacção enzimática fundamental consiste numa única enzima e num único substrato, onde a enzima livre (E) se liga reversivelmente ao substrato (S) para formar o complexo (C), e o complexo dissocia-se irreversivelmente no produto (P) e na enzima livre:
onde a concentração total de enzimas (E T ≡ C + E) e a concentração total do substrato e do produto (S T ≡ S + C + P) são conservadas. Um modelo popular que descreve a acumulação do produto ao longo do tempo é baseado na equação MM, como se segue (ver Método Suplementar para derivação detalhada):
onde K M = (k b + k cat )/k f é a constante de Michaelis-Menten e k cat é a constante catalítica. Este modelo sQ derivado com a QSSA padrão tem sido amplamente utilizado para estimar os parâmetros cinéticos, K M e k cat a partir da curva de progresso do produto8,9,10,11,23,25. Outro modelo que descreve o acúmulo do produto é derivado com o QSSA total; foi desenvolvido mais tarde que o modelo sQ e, portanto, recebeu menos atenção para a estimativa dos parâmetros26,27,28,29:
Embora este modelo tQ seja mais complicado que o modelo sQ, é preciso em gamas mais amplas que o modelo sQ. Especificamente, o modelo sQ é preciso quando
o que requer uma baixa concentração enzimática7,14. Por outro lado, o modelo tQ é preciso quando
onde K = k b /k f é a constante de dissociação27,28,29. Importante, esta condição é geralmente válida e, portanto, o modelo tQ, ao contrário do modelo sQ, é preciso mesmo quando a enzima está em excesso. Veja14,30 para mais detalhes.
A seguir, investigamos a precisão das simulações estocásticas realizadas com ambos os modelos. Especificamente, comparamos as simulações estocásticas usando o algoritmo Gillespie baseado nas funções de propensão do modelo completo original (descrito na Tabela S1), do modelo sQ (Tabela S2) ou do modelo tQ (Tabela S3) para 9 condições diferentes31,32,33,34,35,36: E T é menor que, similar ou maior que K M , e S T também é menor que, similar ou maior que K M (Fig. 1). As simulações estocásticas do modelo sQ não se aproximam das do modelo completo original quando E T não é baixo (ou seja, E T é inferior a nem S T nem K M ). Por outro lado, as simulações estocásticas usando o modelo tQ são precisas para todas as condições (Fig. 1), como é consistente com um estudo recente mostrando que as simulações estocásticas com os modelos sQ e tQ são precisas quando suas condições determinísticas de validade se mantêm (Eqs (3) e (4))37,38. Em conjunto, o modelo tQ é válido para uma gama mais ampla de condições do que o modelo sQ no sentido determinístico e estocástico.
Quando o modelo sQ não se aproxima do modelo original completo à medida que o E T aumenta, o modelo tQ é preciso independentemente do E T . Simulações estocásticas do modelo completo original (Tabela S1), do modelo sQ (Tabela S2) e do modelo tQ (Tabela S3) foram realizadas com S T = 0.2, 2, ou 80 nM, e E T = 0.2, 2, ou 40 nM. Note que estas concentrações são inferiores, semelhantes ou superiores a K M ≈ 2 nM. Aqui, as linhas e faixas coloridas representam uma trajetória média e faixa de flutuação (±2σ da média) de 104 simulações estocásticas.
As estimativas com o modelo tQ são imparciais para qualquer combinação de concentrações de enzimas e substratos
Porque o modelo tQ é preciso para uma gama mais ampla de condições do que o modelo sQ é (Fig. 1), nós colocamos a hipótese de que a estimativa do parâmetro baseado no modelo tQ também é precisa para condições mais gerais. Para investigar esta hipótese, primeiro geramos 102 curvas de progresso ruidosas de P a partir das simulações estocásticas do modelo completo original (Fig. S1). Em seguida, inferimos parâmetros (k cat e K M ) a partir desses conjuntos de dados simulados aplicando a inferência Bayesiana com as funções de probabilidade baseadas no modelo sQ ou no modelo tQ, sob priores gama pouco informativos (Fig. S2) (ver Métodos para detalhes). Note que ao longo deste estudo, temos usado as curvas de progresso do produto simulado (por exemplo, Fig. S1) porque precisamos conhecer os valores reais dos parâmetros para a comparação precisa das estimativas baseadas no modelo sQ e no modelo tQ.
Focamos primeiro na estimativa do gato k sob a suposição de que o valor de K M é conhecido. Quando E T é baixo, para que tanto o modelo sQ como o tQ sejam precisos (Fig. 1 esquerda), as amostras posteriores obtidas com ambos os modelos são semelhantes e capturam com sucesso o valor verdadeiro de k cat (Fig. 2a esquerda). As amostras posteriores obtidas com os dois modelos são semelhantes porque, quando E T é baixo e portanto {E}_{T}{S}_{T}+{K}_{M}}, ambos os modelos (Eqs 1 e 2) são aproximadamente equivalentes como se segue:
onde a primeira aproximação vem da expansão de Taylor em termos de {E}_{T}({S}_{T}_{T}-P)/({E}_{T}+{K}_{M}+{S}_{T}-P)ll 1) (ver27,28,29 para detalhes). Portanto, quando o modelo sQ é preciso, as estimativas com o sQ e os modelos tQ devem ser semelhantes. Por outro lado, quando E T é alto, mostram diferenças claras (Fig. 2a direita): as amostras posteriores obtidas com o modelo sQ mostram grandes erros, enquanto aquelas obtidas com o modelo tQ capturam com precisão o verdadeiro valor de k cat .
A estimativa de um único parâmetro (k cat ou K M ) com o modelo sQ ou com o modelo tQ. Para cada condição (S T = 0.2, 2, ou 80 nM, e E T = 0.2, 2, ou 40 nM), 105 amostras posteriores de k cat (a) ou K M (b) foram obtidas aplicando a inferência Bayesiana a 102 conjuntos de dados ruidosos (Fig. S1) (ver Métodos para detalhes). Quando o k cat é amostrado, o K M é fixado no seu valor verdadeiro (a) e vice versa (b). Aqui, os triângulos verdes indicam os valores verdadeiros dos parâmetros. Enquanto as estimativas de k cat e K M obtidas com o modelo sQ são enviesadas à medida que o E T aumenta, as obtidas com o modelo tQ têm um enviesamento insignificante, independentemente das condições (Ver Fig. S3 para os gráficos da caixa de estimativas). Conforme E T ou S T aumenta, a variância posterior de K M aumenta quando o modelo tQ é utilizado.
Resultados semelhantes também são observados nos gráficos de médias posteriores e coeficiente de variação posterior (CVs) (Fig. S3a,b). Enquanto as médias posteriores obtidas com o modelo sQ são tendenciosas quando E T é alto, aquelas obtidas com o modelo tQ são precisas para todas as condições (Fig. S3a). Em particular, as distribuições estreitas das médias posteriores indicam que a estimativa do k gato com o modelo tQ é robusta contra o ruído nos dados (Fig. S1). Além disso, os CVs posteriores são muito menores que os CVs anteriores (Fig. S3b), indicando uma estimativa precisa do k cat com o modelo tQ.
Nexterior, K M foi estimado sob a suposição de que o valor do k cat é conhecido (Fig. 2b). Amostras posteriores do K M obtido com o modelo sQ mostram novamente erros que crescem com o crescente E T . Note que as estimativas de K M são tendenciosas para cima, o que implica que a utilização das estimativas posteriores de K M para validar a equação MM ({K}_{M}}_gg {E}_{T}}) pode ser enganosa. Por outro lado, as estimativas de K M obtidas com o modelo tQ são pouco tendenciosas para todas as condições. No entanto, ao contrário das distribuições posteriores estreitas de k cat (Fig. 2a), as de K M obtidas com o modelo tQ tornam-se mais largas; assim a precisão diminui à medida que E T ou S T aumenta (Fig. 2b). Estes padrões também são observados nas parcelas de caixa de meios posteriores e CVs posteriores (Fig. S3c,d). O problema de identificabilidade surge porque, quando {E}_{T}_gg {K}_{M}) ou {S}_{T}_gg {K}_{M}) e assim {E}_{T}+{S}_{T}_gg {K}_{M}), o K M é insignificante no modelo tQ (Eq. 2), como se segue:
Especificamente, quando K M é muito baixo, o valor de K M tem pouco efeito sobre a dinâmica do modelo tQ e, portanto, o K M é estruturalmente inidentificável. Em conjunto, as estimativas de K M com os modelos sQ e tQ não são satisfatórias, embora por diferentes razões: as estimativas com o modelo sQ podem ser tendenciosas e aquelas com o modelo tQ podem ser estruturalmente não-identificáveis (Fig. 2b). Padrões semelhantes também foram observados quando um anterior mais informativo foi dado (Fig. S4). Em particular, mesmo com o prior informativo, as estimativas obtidas com o modelo sQ ainda mostram um erro considerável, pois o E T aumenta.
A estimação simultânea de k cat e K M sofre da falta de identificabilidade
Próximo, consideramos a estimação simultânea de dois parâmetros, k cat e K M , que é o objetivo típico da cinética enzimática. Para os mesmos priores gama usados na estimação de um único parâmetro (Fig. 2), as distribuições das amostras posteriores obtidas com ambos os modelos tornaram-se mais amplas em geral (Fig. 3). Para encontrar a razão de tal estimativa imprecisa, analisamos as parcelas de dispersão das amostras de gato k posterior e K M (Fig. 4). Quando o modelo K (Fig. 4) (Fig. 5). 4a-c), as amostras posteriores de k cat e K M obtidas com o modelo sQ apresentaram uma forte correlação, pois a dinâmica do modelo sQ depende apenas da razão k cat /K M , como visto na seguinte aproximação:
onde {K}_{M}_gg {S}_{T}_ge {S}_{T}-P}) é usado. Por outro lado, quando {S}_{T}_gg {K}_{M}} (Fig. 4g-i), o gráfico de dispersão do modelo sQ se torna horizontal, indicando a inidentificabilidade da estrutura do K M . De fato, o valor de K M quase não tem efeito na dinâmica do modelo sQ, como visto na aproximação a seguir:
where K M + S T ≈ S T é usado como \({S}_{T}_{T}}}_{K}_{M}}). Tal falta de identificabilidade de parâmetros quando {S}_{T}_{M}_{K}_{M}} ou {S}_{T}_gg {K}_{M}}) é consistente com estudos anteriores, que recomendam o uso de S T ≈ K M para uma estimativa mais precisa22,23. Entretanto, mesmo quando S T ≈ K M , as estimativas ainda são imprecisas (Fig. 3a e b do meio). Além disso, como E T aumenta, as estimativas obtidas com o modelo sQ são tendenciosas (Fig. 3), como na estimativa de um parâmetro único (Fig. 2). Com base nesta análise parece que a estimativa simultânea de k cat e K M com o modelo sQ é um desafio devido a problemas de identificação e viés.
As parcelas de dispersão de amostras posteriores obtidas com a estimativa de dois parâmetros (Fig. 3). Os gráficos de dispersão implicam em dois tipos de unidentifiabilidade da estrutura: forte correlação entre k cat e K M , e unidentifiabilidade de K M , que é representada como um gráfico horizontal. Os gráficos de dispersão do modelo tQ correlacionados positivamente são alterados para horizontais quando o K M amostrado é muito inferior a S T + E T (linhas cinzas tracejadas). Aqui, triângulos verdes representam os verdadeiros valores dos parâmetros.
Quando \({E}_{T}_{T}\gg {K}_{M}}) ou \({S}_{T}_gg {K}_{M}), o K M tem um efeito negligenciável na dinâmica do modelo tQ (Eq. 6), e assim apenas k cat era identificável na estimativa de um parâmetro (Fig. 2a e b direita ou inferior). Similarmente, quando ambos k cat e K M são inferidos simultaneamente com o modelo tQ, a estimativa de apenas k cat é precisa e precisa (Fig. 3a e b direita ou inferior), como é mostrado pelos gráficos de dispersão horizontal ao longo do valor real de k cat (Fig. 4c,f,g-i). Em outros casos (quando nem {E}_{T}_gg {K}_{M}) nem {S}_{T}_gg {K}_{M})), a variância posterior de ambos os parâmetros aumenta drasticamente em comparação com a estimativa de um único parâmetro (Fig. 2 e 3 à esquerda e superior). Esta estimativa imprecisa provém de duas fontes, de acordo com os gráficos de dispersão (Fig. 4a,b,d,e). Quando k cat e K M diminuem juntos, o comportamento do modelo tQ muda pouco como o modelo SQ (Eq. 5), o que leva a uma forte correlação entre as amostras posteriores de k cat e K M . Como as estimativas de K M continuam diminuindo junto com as de k cat, de modo que se tornam muito menores que E T + S T (linha vertical tracejada da Fig. 4), o modelo tQ não depende mais do valor de K M , como mostrado na Eq. 6, e assim as parcelas de dispersão se tornam horizontais.
Dados combinados de diferentes experimentos permitem uma estimativa precisa e precisa com o modelo tQ
Como mostrado acima, a estimativa de ambos k cat e K M usando uma única curva de progresso sofre de considerável viés e falta de identificabilidade (Figs 3 e 4), o que é consistente com estudos anteriores relatando que uma curva de progresso obtida de um único experimento não é suficiente para identificar ambos os parâmetros simultaneamente19. Assim, aqui, investigamos se o uso de múltiplos conjuntos de dados de cursos de tempo obtidos sob diferentes condições experimentais pode melhorar a estimativa.
Em ensaios típicos in vitro, as curvas de progresso são medidas com um S T fixo e um E T variado ou um E T fixo e S T variado 8,9,10,11,39. Primeiro consideramos o caso quando as curvas de progresso são medidas com um S T fixo e um E T variado. Especificamente, curvas de progresso tanto de E T baixo como de E T alto são usadas para estimar parâmetros para um S T fixo em diferentes níveis (Fig. S1 superior e inferior). Neste caso, as amostras posteriores obtidas com o modelo sQ apresentam erros consideráveis, uma vez que os dados de E T elevado são utilizados (Fig. 5a e S5). Por outro lado, as amostras posteriores obtidas com o modelo tQ captam com precisão os valores verdadeiros tanto de k cat como de K M com baixa variação (Figs 5a e S5). Tal melhora decorre do fato de que os dados obtidos sob o E T baixo e alto fornecem diferentes tipos de informação para a estimação dos parâmetros. Especificamente, a partir dos dados do E T alto, embora o K M não seja identificável, o k cat pode ser estimado com precisão com o modelo tQ (Fig. 4c,f,i). Essa estimativa precisa do k cat a partir dos dados E T altos pode impedir a correlação entre o k cat e o K M quando eles são estimados a partir dos dados E T baixos (Fig. 4a,d). De fato, os gráficos estreitos de dispersão do modelo tQ (Fig. 5b esquerda e meio) são a intersecção de dois gráficos de dispersão, um horizontal obtido com os dados E T altos (Fig. 4c,f) e um não horizontal obtido com os dados E T baixos (Fig. 4a,d). Entretanto, quando S T é alto, o gráfico de dispersão do E T baixo também se torna horizontal (Fig. 4c), e assim o efeito sinérgico do uso de dados combinados diminui (Fig. 5a,b direita). Em conjunto, o modelo tQ pode estimar com precisão ambos os parâmetros a partir da combinação de dados E T baixos e E T altos quando S T não é muito maior que K M . Note que esse S T baixo é preferido para experiências in vitro24,39,40,41 e é o caso da maioria das condições fisiológicas24,
Quando os dados obtidos sob E T baixo e E T alto são utilizados em conjunto, a precisão e a precisão das estimativas obtidas com o modelo tQ, mas não com o modelo sQ, são melhoradas. (a) As amostras posteriores são inferidas usando conjuntos de dados de E T = 0,2 nM (Fig. S1 superior) e E T = 40 nM (Fig. S1 inferior) juntos para S T = 0,2, 2, ou 80 nM. A variância posterior do modelo tQ diminui drasticamente para o nível da estimativa de parâmetro único (Fig. 2). Entretanto, as estimativas do modelo sQ mostram um viés considerável. Aqui, os triângulos verdes representam os verdadeiros valores de k cat ou K M . (b) As parcelas de dispersão das amostras posteriores. Aqui, triângulos verdes, círculos azuis e quadrados vermelhos representam os valores verdadeiros, meios posteriores do modelo sQ, e os do modelo tQ, respectivamente.
Próximo, consideramos o caso quando as curvas de progresso são medidas com um E T fixo e um S T variado. Especificamente, a combinação de duas curvas de progresso de S T baixo e S alto é usada para inferir parâmetros para um E T fixo em diferentes níveis (Fig. S1 esquerda e direita). Quando E T é baixo, e portanto os modelos sQ e tQ comportam-se de forma semelhante (Eq. 5), as amostras posteriores obtidas com ambos os modelos captam com precisão os valores verdadeiros de k cat e K M (Fig. 6a esquerda e S6). Novamente, o gráfico de dispersão estreito (Fig. 6b esquerda) é obtido como a intersecção de um gráfico de dispersão não horizontal de S T baixo (Fig. 4a) e um gráfico de dispersão horizontal de S T alto (Fig. 4g). No entanto, como E T aumenta, e assim o modelo sQ se torna menos preciso, aqueles obtidos com o modelo sQ são tendenciosos, como esperado (Fig. 6a direita e S6). Enquanto tais vieses não são observados naqueles obtidos com o modelo tQ, a precisão das estimativas de K M diminui à medida que E T aumenta, como na estimativa de um parâmetro (Fig. 2 e Eq. 6).
Estimativa usando os dados obtidos sob S T baixo e S T alto juntos. (a) As amostras posteriores são inferidas usando conjuntos de dados de S T = 0,2 nM (Fig. S1 esquerda) e S T = 80 nM (Fig. S1 direita) juntos para E T = 0,2, 2, ou 40 nM. Quando E T é baixo, ambos os modelos sQ e tQ permitem uma estimativa precisa e precisa. Conforme E T aumenta, as estimativas obtidas com o modelo sQ tornam-se imprecisas, e as estimativas de K M obtidas com o modelo tQ tornam-se menos precisas, semelhantes à estimativa de parâmetro único (Fig. 2). Aqui, os triângulos verdes representam os verdadeiros valores de k cat ou K M . (b) As parcelas de dispersão das amostras posteriores. Aqui, triângulos verdes, círculos azuis e quadrados vermelhos representam os valores verdadeiros, meios posteriores do modelo sQ, e os do modelo tQ, respectivamente.
Desenho otimizado dos experimentos para estimação precisa e eficiente com o modelo tQ
Quando uma curva de progresso obtida de um único experimento é usada, os gráficos de dispersão posterior do modelo tQ podem ser categorizados como um tipo correlacionado (Fig. 4a,b,d,e) e um tipo horizontal (Fig. 4c,f,g-i). As intersecções destes dois tipos diferentes de gráficos de dispersão tendem a ser distribuídas de forma estreita e próxima do valor real (Fig. 5b e 6b). Assim, a combinação desses dois conjuntos de dados permite estimar com precisão tanto k cat como K M (Figs 5a e 6a). Especificamente, uma curva de progresso medida sob {E}_{T}_{K}_{M}} e {S}_{T}_ll {K}_{M}) (Fig. 4a,b,d,e) e uma medida sob {E}_{T}_gg {K}_{M}) ou {S}_{T}_gg {K}_{M}) (Fig. 4a,b,d,e) e uma medida sob {E}_{T}_gg {K}_{M}) (Fig. 5a e 6b). 4c,f,g-i) fornecem diferentes tipos de informação para a estimativa de parâmetros; assim, o uso de ambos os conjuntos de dados leva a uma estimativa bem sucedida. Entretanto, é difícil comparar os valores de S T , E T , e K M na prática, porque o valor de K M é geralmente desconhecido a priori. Este problema pode ser facilmente resolvido com o uso do gráfico de dispersão. Isto é, se o gráfico de dispersão posterior obtido no primeiro experimento for horizontal, então tanto E T como S T devem ser diminuídos para o próximo experimento, para que o gráfico de dispersão não horizontal possa ser obtido (Fig. 7a). Por outro lado, se o gráfico de dispersão do primeiro experimento mostrar uma forte correlação entre K M e k cat , então ou S T ou E T deve ser aumentado no próximo experimento (Fig. 7b). Basicamente, sem qualquer informação prévia do valor de K M e k cat , a forma dos gráficos de dispersão das estimativas atuais determina o próximo desenho experimental ótimo, o que garante uma estimativa precisa e precisa. Entretanto, esta abordagem não pode ser usada com o modelo sQ, pois a estimativa com o modelo sQ pode ser tendenciosa, dependendo da relação entre E T ou S T e K M , que é desconhecida a priori. Ou seja, ao contrário do modelo tQ, uma estimativa precisa nem sempre garante uma estimativa precisa com o modelo sQ, como visto acima (por exemplo, Fig. 5a à direita).
O desenho experimental ideal para uma estimativa precisa e precisa com o modelo tQ. (a) Quando o gráfico de dispersão de amostras posteriores do primeiro experimento é horizontal, E T e S T precisam ser diminuídos para obter o gráfico de dispersão não horizontal no próximo experimento. Então, usando a combinação dos dois experimentos leva a uma estimativa precisa e precisa (gráficos de dispersão vermelha). (b) Quando o gráfico de dispersão do primeiro experimento é não-horizontal, E T ou S T precisa ser aumentado no próximo experimento para obter um gráfico de dispersão horizontal. (c) A inferência com uma única curva de progresso a partir do E T baixo (0,1 K M ) e do E T alto (10 K M ) leva a gráficos de dispersão não horizontais e horizontais, respectivamente, para quimotripsina, urease e fumarase (gráficos de dispersão cinza). Quando ambos os conjuntos de dados foram usados em conjunto, estimativas precisas foram obtidas para todas as enzimas (parcelas de dispersão vermelha). Aqui, é usado S T baixo (0.1 K M ). Aqui, triângulos verdes representam os verdadeiros valores dos parâmetros.
Testamos se a abordagem proposta com o modelo tQ pode estimar com precisão k cat e K M para catálise do éster etílico N-acetilglicina, fumarato e uréia pelas enzimas a quimotripsina, urease e fumarase, respectivamente (Fig. 7c). Estas três enzimas foram escolhidas porque têm eficiências catalíticas diferentes (k cat /K M )1: 0.12, 4 – 105, e 1.6 – 108 s -1 M -1, respectivamente. Para cada enzima, foram gerados 102 conjuntos de dados de tempo ruidosos usando simulações estocásticas baseadas em parâmetros cinéticos enzimáticos conhecidos1. Quando curvas de progresso obtidas com baixo E T e baixo S T são usadas, como esperado, gráficos de dispersão não-horizontal de amostras posteriores foram obtidos para as três enzimas (Fig. 7c). Isto indica que o E T ou S T deve ser aumentado no próximo experimento para se obter um gráfico de dispersão horizontal. De fato, quando uma curva de progresso com um aumento de 100 vezes de E T foi usada, gráficos de dispersão horizontal foram obtidos para todas as enzimas (Fig. 7c). Portanto, quando estas duas curvas de progresso são usadas juntas, ambos k cat e K M podem ser estimados com precisão (Fig. 7c pontos vermelhos). Esses resultados suportam que esse desenho experimental otimizado em duas etapas (Fig. 7a,b) para obter dois tipos diferentes de gráficos de dispersão permite uma estimativa precisa e eficiente da cinética enzimática com o modelo tQ. O pacote computacional que realiza tal estimativa é fornecido (veja Método para os detalhes).