INTRODUCTION
Ibuprofen pertence ao grupo dos anti-inflamatórios não esteróides (AINE) usados para tratar diversos processos inflamatórios, dor ou febre. O mecanismo subjacente aos efeitos do ibuprofeno deriva da inibição da atividade da ciclo-oxigenase (COX), que é necessária para a síntese da prostaglandina (PG).1 PG são produzidos a partir do ácido araquidônico derivado da membrana plasmática e a produção local de PG tem efeitos semelhantes aos hormônios. Duas isoformas COX são expressas em tecidos humanos: a isoforma COX-1 expressa constitutivamente existe na maioria dos tecidos, enquanto a isoforma COX-2 é fortemente induzida durante a resposta inflamatória, incluindo condições patológicas de inflamação crônica e câncer de cólon.2 Entre os diferentes produtos derivados da COX-2, os níveis mais elevados de PGE2 são encontrados em tumores e afetam vários processos, incluindo proliferação celular e apoptose.3 Em fisiologia normal, o PGE2 desempenha um papel na manutenção dos processos reguladores da mucosa gastrointestinal, como secreção de muco e dilatação dos vasos sanguíneos.4 Assim, o tratamento prolongado com NSAID pode levar a efeitos colaterais, incluindo sangramento intestinal. A maioria dos AINE, incluindo ibuprofeno, inibe ambas as isoformas COX.
O uso profilático de AINE foi documentado para reduzir o risco de morte por câncer colorretal.5-9 Por exemplo, uma dose diária de 300 mg de aspirina durante um período de 10 anos revelou um efeito protetor estatisticamente significativo.7,10,11 Uma redução de risco semelhante foi relatada com uma dose diária de ibuprofeno de 200 mg8,11-19 para vários tipos de tumor: 51% de redução no risco para o cólon, 72% para a mama, 62% para a próstata e 59% para o câncer de pulmão.19
COMO FAZ O CÂNCER IBUPROFEN PREVENTE?
Provas acumuladas revelaram que a inflamação promove tumores,20,21 em particular quando o tecido está sob condições inflamatórias crônicas. Dentro do microambiente tumoral, as células inflamatórias trocam sinais com as células tumorais. As células do estroma secretam fatores de sobrevivência para as células tumorais, enquanto as células tumorais produzem citocinas, que provocam a remodelação proteolítica da matriz extracelular pelas células do estroma, ou a formação de novos vasos sanguíneos.20,22 O ibuprofeno inibe a atividade COX e a subseqüente geração de PG pró-inflamatório; acredita-se que esta ação esteja subjacente ao efeito quimiopreventivo do ibuprofeno. O PGE2, por exemplo, ativa receptores de PGE2 acoplados à proteína G que estimulam várias vias de sinalização envolvidas na proliferação e sobrevivência celular.23,24
Neste artigo, os autores revisam mecanismos de ação adicionais que são independentes da inibição da COX-2 com o objetivo de aumentar a consciência de que os efeitos clínicos do ibuprofeno podem ser mediados por vários processos celulares. As evidências apresentadas foram recuperadas do mecanismo de busca da PubMed usando “ibuprofeno E câncer” como termo de busca. Estudos relatando efeitos independentes do COX, incluindo os realizados no laboratório dos autores, foram selecionados para revisão.
MECANISMOS ADICIONAIS ATRAVÉS DO QUE O IBUPROFÉNIO INIBE CÉLULAS TUMORES
Em 2015, Matos e Jordan25 revisaram o tratamento de células cancerígenas com ibuprofeno. As células colorrectais HCT-116 não expressam COX-2, mas o tratamento com 2 mMol/L ibuprofeno produziu efeitos proapoptóticos.26 O ibuprofeno a uma baixa concentração de 100 µMol foi ainda identificado como um ligante direto e independente de COX da gama de receptores peroxisômicos ativados por proliferadores (PPARγ),27 e demonstrou estimular sua atividade nuclear em modelos de ratos com formação de câncer de cólon.28 Assim, a ação proapoptótica observada para o ibuprofeno pode em parte resultar da ativação do PPARγ, o que leva à desregulamentação do fator de transcrição antiapoptótica NFκB.28
Foi relatado que uma outra resposta celular independente do COX após o tratamento com ibuprofeno envolveu P75NTR, um membro da superfamília receptora do TNF. O tratamento das células cancerosas com 1 mMol/L ibuprofeno resultou em uma estabilização dependente da via mitogenética da proteína quinase p38 da estabilidade do mRNA do p75NTR, levando a um aumento dos níveis de expressão29 e indução de apoptose e supressão do crescimento.30
Foi relatada uma ação promotora de apoptose semelhante nas células HCT116, quando foi encontrado tratamento com ibuprofeno (1,5 mM durante 24 horas) para sensibilizar estas células contra o ligante indutor de apoptose relacionado ao TNF.31 O mecanismo subjacente envolveu a expressão do receptor de membrana para o ligante indutor de apoptose relacionado ao TNF: receptor de morte 5, outro membro da superfamília do receptor de TNF.
tratamento com ibuprofeno (1 mMol/L por 24 horas) foi ainda relatado para reduzir significativamente os níveis nucleares de β-catenin em células tumorais colorrectais SW480 e DLD-1. Consistentemente, a expressão de um de seus alvos transcripcionais, o gene pró-proliferativo da ciclina D1, foi suprimida.32 Embora o mecanismo subjacente ainda não tenha sido determinado, este efeito do ibuprofeno parece de especial interesse para a prevenção do câncer colorretal porque a sinalização excessiva de β-catenin pode causar estimulação inadequada do crescimento das células-tronco da mucosa do cólon.33
Concorrente ao efeito da sinalização de β-catenin, o ibuprofeno também interferiu diretamente no caminho NFκB. Um efeito rápido do tratamento com ibuprofeno observado nas células é a fosforilação inibitória da GSK-3β na serina 9,32 Esta modificação foi encontrada para regular negativamente a sinalização de NFκB, em um passo abaixo da degradação de sua proteína inibidora IkBα, e para suprimir a expressão de genes alvo anti-apoptóticos NFκB, tais como BCL2 e BIRC5.
Outros exemplos de efeitos independentes do COX de 100 µMol ibuprofeno incluem a inibição da expressão da integrina em neutrófilos34 ou a liberação de citocinas pró-inflamatórias em células HCT-116 e HeLa, mediadas por caspas.35
IBUPROFEN, ALTERNATIE SPLICING, AND CANCER
Células cancerígenas diferem em seu programa de expressão gênica de suas correspondentes células normais diferenciadas. Além da regulação transcripcional nos promotores gênicos, os últimos 15 anos revelaram claramente que a emenda alternativa serve como um mecanismo significativo para a regulação da expressão gênica. Por exemplo, a emenda alternativa gera variantes transcript que podem ser não funcionais e rapidamente degradadas ou ser traduzidas em isoformas proteicas com propriedades funcionais diferentes, às vezes antagônicas, devido ao uso diferencial de domínios proteicos funcionais.36,37
Recentemente, a inibição da variante alternativa de emenda RAC1b foi identificada como outro efeito independente do COX do ibuprofeno.38 A inflamação do cólon foi mostrada como um gatilho para aumento da expressão da proteína RAC1b relacionada ao tumor, uma variante de emenda da pequena RAC1 da GTPase GTPase. A proteína RAC1b contém um domínio adicional codificado por um exon alternativo de 57 pares de base (exon 3b), que confere maior ativação da proteína, gerando uma variante hiperativa capaz de estimular a sinalização NFκB.39-42 Quando células colorretais foram tratadas com ibuprofeno, mas não com aspirina ou flurbiprofeno, tanto o mRNA quanto os níveis protéicos de RAC1b foram acentuadamente reduzidos in vitro e in vivo.38 Enquanto muitos estudos sobre o efeito do AINE na viabilidade celular do tumor utilizaram concentrações de até 2 mMol/L,43 o efeito do ibuprofeno na emenda alternativa de RAC1b foi observado em baixas doses de 100 µMol. Curiosamente, o ibuprofeno inibiu as células colorrectais HT29 com RAC1b positivo mais do que os colonócitos normais e também afectou o seu crescimento como xenoenxertos tumorais subcutâneos em ratos. O efeito inibitório do ibuprofeno pôde ser resgatado quando uma sequência de cDNA RAC1b independente de emendas foi expressa em células HT29.38 Isto sugere que o ibuprofeno age diretamente no evento de emenda alternativo.
Um outro relatório sobre a modulação da emenda alternativa foi obtido quando células cancerosas da próstata receberam tratamento combinado de ibuprofeno e epigalocatequina-3-galato (EGCG), um componente de chá verde com propriedades anticarcinogênicas que promove parada do ciclo celular G0/G1 e apoptose. Neste caso, o equilíbrio entre as variantes anti e proapoptóticas de BCL-X e MCL-1 foi deslocado para as variantes BCL-X(S) ou MCL-1(S) mais curtas e proapoptóticas.44 Embora o mecanismo não tenha sido totalmente identificado, ele envolve a ativação da proteína fosfatase PP1, que é conhecida por desfosforatar proteínas reguladoras envolvidas na emenda do pré-mRNA.
MECANISMO DE MODULAÇÃO POR IBUPROFEN
Quando os genes codificadores de proteína são expressos em células humanas, a RNA polimerase 2 gera uma transcrição primária, o pré-mRNA, que contém exons codificadores separados por sequências intrônicas. Enquanto a transcrição é contínua, as seqüências de nucleotídeos conservados ao redor de cada junção exon-intron são reconhecidas pelo emenda, uma máquina macromolecular envolvendo cinco pequenas partículas de ribonucleoproteínas nucleares (U1, U2, U4, U5 e U6),45,46 que então remove introns durante o processo de emenda do mRNA. A função do emenda é auxiliada por elementos melhoradores ou silenciadores, sequências curtas encontradas em exons ou introns, que promovem ou inibem o reconhecimento produtivo de um determinado exon pelo emendador. Os factores de emenda reconhecem estes elementos melhoradores de emenda ou silenciadores, que pertencem principalmente à família das proteínas rica em serina e arginina ou às ribonucleoproteínas nucleares heterogéneas. Muitas vezes agem de forma antagónica, de modo que a modulação da ligação proporciona um mecanismo que permite a inclusão ou omissão de exon alternativos e, portanto, a geração de transcrições de variantes. No conjunto, o conjunto de fatores de emenda expressos em uma determinada célula e seus níveis relativos de expressão no núcleo da célula operam em um modo combinatório para regular a emenda alternativa.
No caso do RAC1b, a emenda alternativa é regulada por um elemento melhorador no exon 3b, que é reconhecido pelo fator de emenda SRSF1, e um elemento silenciador adjacente reconhecido por SRSF3.47
Em células colorrectais humanas, a disponibilidade de SRSF1 no núcleo é o principal fator regulador da inclusão ou pulo do exon 3b.48
Um mecanismo pelo qual o ibuprofeno afeta a emenda alternativa nas células é o status de fosforilação de SRSF1. Experiências de fracionamento celular e immunoblot revelaram que o tratamento com ibuprofeno causou uma redução na fosforilação de SRSF1 (dados não publicados). Pelo contrário, o tratamento com aspirina não teve tal efeito sobre o SRSF1. Isto mostrou que o efeito inibitório do ibuprofeno na emenda de RAC1b envolveu regulação pós-tradução da localização subcelular de SRSF1.48
A principal proteína quinase responsável pela fosforilação de SRSF1 é a SRPK1, que é encontrada tanto no citoplasma quanto no núcleo celular.49,50 Este processo é, em parte, controlado pela sinalização do receptor do fator de crescimento.51 Como mostrado e descrito na Figura 1, os autores observaram que o tratamento com ibuprofeno induziu a translocação de SRPK1 do núcleo para o citoplasma, e isto correlacionou com níveis reduzidos de fosforilação de SRSF1 e proteína RAC1b como detectado em lisados de células inteiras por western blot. Não foi observado tal efeito quando as células foram tratadas com aspirina nas mesmas condições, sublinhando a ação independente do COX do ibuprofeno e a especificidade de seu efeito na modulação do fator de emenda.