Materialien und Methoden
Teilnehmer
Die Probanden waren 83 Kinder mit ADHS (75 % männlich) und 72 TD-Kinder (51 % männlich) im Alter zwischen 6 und 13 Jahren. Die Einschlusskriterien für die ADHS-Gruppe waren: (a) eine klinische Diagnose von ADHS gemäß den DSM-IV-Kriterien, (b) Bestätigung dieser Diagnose durch den Diagnostic Interview Schedule for Children, vierte Auflage, der den Eltern vorgelegt wurde (DISC-IV-P; ), (c) signifikante ADHS-Symptome, angegeben durch Elternbewertungen >90. Perzentil auf mindestens einer der ADHS-Skalen (Unaufmerksamkeit und Hyperaktivität/Impulsivität) der Disruptive Behaviour Disorder Rating Scale (DBDRS; ), und (d) durchdringende ADHS-Symptome, angegeben durch Lehrerbewertungen >75. Perzentil auf mindestens einer der ADHS-Skalen der DBDRS. Das Vorliegen einer komorbiden Diagnose (z. B. ODD oder ASD) war kein Ausschlusskriterium, ebenso wenig wie eine Behandlung mit stimulierenden Medikamenten. Kinder, die Stimulanzien einnahmen (N = 50, 60 % der ADHS-Gruppe), setzten die Medikamente 24 Stunden vor dem Test und während der Teilnahme an unserer Studie ab, um ein vollständiges Ausschwemmen zu ermöglichen. Die Einschlusskriterien für die TD-Gruppe waren: (a) keine klinische Diagnose einer Entwicklungs- oder Verhaltensstörung (einschließlich ADHS und ODD) und (b) Werte <90. Perzentil auf den von Eltern und Lehrern bewerteten ADHS-Skalen der DBDRS.
Materialien
Verhalten.
Eltern von Kindern, die für die Aufnahme in die ADHS-Gruppe in Frage kamen, wurden mit dem DISC-IV-P-Teil zur Störung des störenden Verhaltens bewertet. Der DISC-IV-P ist ein weit verbreitetes standardisiertes diagnostisches Interview für die Beurteilung von psychiatrischen Störungen im Kindesalter nach DSM-IV mit angemessenen psychometrischen Eigenschaften.
Eltern und Lehrer der Kinder in der ADHS- und der TD-Gruppe füllten den DBDRS aus, um die ADHS-Symptome und die Symptome von ODD und CD zu beurteilen. Die DBDRS enthält vier Skalen zur Messung der Symptome von Unaufmerksamkeit, Hyperaktivität/Impulsivität, ODD und CD auf einer 4-Punkte-Likert-Skala (von 0 bis 3), wobei höhere Punktzahlen eine Verschlechterung der Symptome anzeigen. Für die DBDRS wurden adäquate psychometrische Eigenschaften berichtet.
Die Strengths and Weaknesses of ADHD-symptoms and Normal Behaviour rating scale (SWAN; ) wurde von Eltern und Lehrern ausgefüllt, um die Symptome von ADHS zu beurteilen. Dieser weit verbreitete Fragebogen enthält zwei Unterskalen: die Skala für Unaufmerksamkeit und die Skala für Hyperaktivität/Impulsivität, die jeweils 9 Items umfassen. Die Items werden auf einer 7-stufigen Likert-Skala (von -3 bis +3) bewertet, wobei höhere Punktzahlen eine Verschlechterung der Symptome anzeigen. Die Items basieren auf den DSM-IV-Symptomen von ADHS, spiegeln aber beide Enden (stark und schwach) des in jedem ADHS-Symptom beschriebenen Verhaltens wider. Als abhängige Variablen wurden die Mittelwerte der beiden Subskalen verwendet.
Die ADHS-Symptome wurden mit der 65 Items umfassenden Social Responsiveness Scale (SRS; ) erfasst, die von Eltern und Lehrern ausgefüllt wurde. Die Items der SRS basieren auf den DSM-IV-Symptombereichen der ASD, einschließlich der Beeinträchtigung der sozialen Interaktion, kommunikativer Defizite und eingeschränkter/stereotyper Verhaltensmuster oder Interessen. Der SRS verwendet eine 4-Punkte-Likert-Skala (von 0 bis 3), und die Summe der Punkte auf der gesamten SRS-Skala wurde als abhängiges Maß verwendet, wobei höhere Punktzahlen auf schlechtere Symptome hinweisen. Die SRS hat angemessene psychometrische Eigenschaften.
Blutspots.
Um die Blutkonzentrationen von Tryptophan, Tyrosin und Phenylalanin zu untersuchen, wurde die Technik der getrockneten Blutspots verwendet. Die Entnahme von Blutspots ist für Kinder weniger invasiv als die Entnahme von venösem Blut, und die Technik der getrockneten Blutspots ist für diagnostische Zwecke ausreichend robust und stabil. Die AAA-Konzentrationen in Blutspots korrelieren stark mit den AAA-Konzentrationen im Serum (rs zwischen .86 und .96). Von jedem Kind wurde ein Blutstropfen mit einer Einweg-Sicherheitslanzette entnommen. Drei Blutstropfen wurden auf eine Blutfleckenkarte getupft. Eine 5,5-mm-Stanze eines getrockneten Blutflecks wurde mit 100 μl einer internen Standardlösung (mit 29 μM L-Phenylalanin-D5, 6 μM L-Tyrosin-D4 und 5 μM L-Tryptophan-D5) und 400 μl Methanol in einem Gaschromatographie-Fläschchen (GC-Fläschchen) gemischt und 15 Minuten lang im Ultraschallbad geschüttelt. Der Überstand wurde in ein anderes GC-Fläschchen überführt und unter Stickstoff bei 30°C eingedampft. Anschließend wurde die Probe mit 100μl 5,5% Acetylchlorid (in n-Butanol) bei 60°C für 15 Minuten butyliert. Danach wurde die Butanolschicht unter Stickstoff (bei 30°C) eingedampft und der Rückstand in 500μl Acetonitril aufgelöst. Die Konzentrationen von Tryptophan, Tyrosin und Phenylalanin in den Blutspots wurden mittels positiver Elektrospray-Flüssigchromatographie-Tandem-Massenspektrometrie (LC-MS/MS) unter Verwendung eines API 3000 Triple-Quadrupol-Massenspektrometers (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) bestimmt, das an ein Hochleistungs-Flüssigchromatographiesystem (HPLC) (Perkin Elmer Serie 200, Shelton, USA) gekoppelt war. Drei μl der Probe wurden auf eine symmetrische C18-Säule (3,9*150mm, 5μm; Waters, Milford, MA, USA) injiziert und mit einer Flussrate von 1ml/min von 75% Acetonitril (mit 0,4% Ameisensäure) eluiert. Tryptophan, Tyrosin und Phenylalanin eluierten innerhalb von 1 Minute und wurden anhand der folgenden Übergänge gemessen: Masse-Ladungs-Verhältnis (m/z) 261,2→159,2 (Tryptophan), m/z 238,2→136,2 (Tyrosin) und m/z 222,2→120,2 (Phenylalanin). Alle erhaltenen LC-MS/MS-Daten wurden mit der Software Analyst 1.4.2 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) erfasst und verarbeitet. Die Blutspotkonzentrationen von Tryptophan, Tyrosin und Phenylalanin wurden in μmol/L ausgedrückt. Die Zuverlässigkeit der LC-MS/MS wurde durch Untersuchung der Inter-Assay-Varianz (5-10 %), der Intra-Assay-Varianz (8-10 %) und der Wiederfindungsrate (90-112 %) bestätigt.
Die tägliche Proteinzufuhr
wurde an drei Tagen anhand eines von den Eltern geführten Ernährungstagebuchs ermittelt. Es wurden standardisierte Ernährungsprotokolle und Anweisungen bereitgestellt. Die Eltern wurden angewiesen, alle verzehrten Lebensmittel und Getränke in das Ernährungstagebuch einzutragen und die verzehrten Mengen so genau wie möglich anzugeben. Die Menge der aufgenommenen Proteine (Gramm/Tag) wurde anhand einer computergestützten Version der niederländischen Datenbank für Lebensmittelzusammensetzung berechnet. Die niederländische Datenbank für die Zusammensetzung von Lebensmitteln enthält über 2000 Lebensmittel mit Informationen über die Nährstoffzusammensetzung dieser Lebensmittel. Die Datenbank wird häufig für wissenschaftliche Zwecke verwendet (z. B.).
Urin.
Um die AAA-Konzentrationen im Urin zu untersuchen, sammelten die Teilnehmer den gesamten Urin, der innerhalb von 18 aufeinander folgenden Stunden (nach der Schule) ausgeschieden wurde, in einem Urinsammelbehälter. Während der Urinsammlung wurde der Behälter in einem Kühlschrank (<5°C) aufbewahrt. Eine 10-ml-Probe wurde zur Analyse an ein Labor geschickt, wo die Probe bei -20°C gelagert wurde. Für die Analyse von Tryptophan im Urin wurde eine HPLC-Technik mit Fluoreszenzdetektion verwendet. Die Konzentrationen von Tyrosin und Phenylalanin im Urin wurden mit einem Biochrom-Aminosäurenanalysator bestimmt. Die Urinkonzentrationen von Tryptophan, Tyrosin und Phenylalanin wurden durch ein Verhältnis von μmol zum Gesamturinvolumen ausgedrückt, um Auswirkungen einer Polyurie oder Oligurie auszuschließen. Die Zuverlässigkeit der HPLC-Technik wurde durch die Untersuchung der Präzision der Analysen bestätigt, die für Tryptophan 2,25 % (relative Standardabweichung) und für Tyrosin und Phenylalanin 1,50 % beträgt. Es bestehen hohe Korrelationen zwischen den Aminosäurekonzentrationen in 12-Stunden-Proben und 24-Stunden-Proben, was darauf hindeutet, dass es keine tageszeitlichen Schwankungen bei der Ausscheidung von Aminosäuren gibt, was die Verwendung einer 18-Stunden-Probe in der vorliegenden Studie bestätigt.
Vorgehensweise
Diese Studie wurde von der lokalen medizinischen Ethikkommission des VU University Medical Center Amsterdam, Niederlande, genehmigt (#NL39922.029.12) und in Übereinstimmung mit den ethischen Standards der Deklaration von Helsinki von 1964 und ihren späteren Änderungen durchgeführt. Vor der Teilnahme an der Studie wurde die schriftliche Einwilligung der Eltern aller Kinder und von Kindern ≥12 Jahren eingeholt. Kinder mit ADHS wurden in psychiatrischen Ambulanzen, über die Elternvereinigung für verhaltensauffällige Kinder und über eine universitäre Forschungswebsite rekrutiert. Die TD-Gruppe wurde aus Grundschulen im ganzen Land rekrutiert. Kinder, die Stimulanzien einnahmen, stellten einen Tag vor der Teilnahme (Tag 0) die Einnahme von Medikamenten ein, um eine vollständige Ausschwemmung zu gewährleisten, und nahmen während der Bewertung der Blut-, Urin- und Nahrungsaufnahme (Tag 1 bis Tag 3) keine Medikamente ein. Am Tag 1 wurde die Blutprobe am frühen Morgen entnommen, um die Auswirkungen der tageszeitlichen Schwankungen der AAA-Konzentrationen im Blut auszuschließen. Am selben Tag wurde nach der Schulzeit mit der Urinsammlung begonnen, die in den folgenden 18 Stunden fortgesetzt wurde, bis das Kind am nächsten Morgen in die Schule zurückkehrte (Tag 2). Am frühen Morgen von Tag 1 erhielten die Eltern ausführliche Anweisungen zum Ausfüllen des Ernährungsprotokolls und zur Urinsammlung ihres Kindes. Nach der Einweisung begannen die Eltern mit der Aufzeichnung der Nahrungsaufnahme ihres Kindes, die an den folgenden drei Tagen (Tag 1 bis Tag 3) fortgesetzt wurde. Eltern und Lehrer wurden aufgefordert, die Fragebögen auf einer gesicherten Website auszufüllen. Alle Daten wurden zwischen Februar 2013 und Juli 2014 erhoben. Die ADHS- und die TD-Gruppe wurden gleichzeitig rekrutiert, um mögliche saisonale Auswirkungen auf die Nahrungsaufnahme oder den AAA-Stoffwechsel zu kontrollieren.
Datenanalyse
Alle statistischen Analysen wurden mit R, Version 3.2.1, durchgeführt. Alle Variablen wurden auf Ausreißer und fehlende Werte für die ADHS- und TD-Gruppe getrennt untersucht. Bei Ausreißern wurde eine Winsorisierung durchgeführt, d. h. sie wurden durch einen Wert ersetzt, der eine Einheit größer (oder kleiner) als der vorhergehende extremste Wert in der Verteilung der Gruppe war. Fehlende Daten bei den Urinkonzentrationen, Ernährungsdaten und Verhaltensdaten wurden zufällig verteilt und durch Gruppenmittelwerte ersetzt. Bei den Blutspots gab es keine fehlenden Daten. Alle Daten waren normalverteilt, mit Ausnahme der CD-Symptome. Gruppenunterschiede in Bezug auf das Geschlecht wurden mit einem Chi-Quadrat-Test untersucht, und Gruppenunterschiede in Bezug auf das Alter und das Verhalten wurden mit t-Tests für unabhängige Stichproben untersucht.
Zur Prüfung der ersten Hypothese wurden Gruppenunterschiede in den AAA-Blutspot-Konzentrationen mit Hilfe von Varianzanalysen (ANOVAs) mit der Gruppe (ADHS oder TD) als festem Faktor bewertet. Die Effektgrößen wurden als partielles Eta-Quadrat berechnet und als klein (>.01), mittel (>.06) oder groß (>.14) interpretiert. Darüber hinaus wurden Odds Ratios berechnet, die das Risiko für eine ADHS-Diagnose bei unterdurchschnittlichen AAA-Konzentrationen ausdrücken. Normative Daten für AAA-Konzentrationen wurden aus einer großen Stichprobe von Kindern im Alter von 6 bis 13 Jahren (N = 104, 52 % Männer) abgeleitet (unveröffentlichte Daten, Informationen zur Stichprobe und Ergebnisse sind bei den Autoren erhältlich). Für jede AAA wurden Konzentrationen, die dem untersten 16. Perzentil (M-1 SD) der normativen Stichprobe entsprechen, als Schwellenwert verwendet, um unterdurchschnittliche AAA-Konzentrationen zu definieren (für Tryptophan 45 μmol/L, Tyrosin 39 μmol/L und Phenylalanin 47 μmol/L). Die Odds Ratios wurden mit ihrem 95 %-Konfidenzintervall berechnet, und der exakte Test von Fisher wurde durchgeführt, um die Signifikanz der Odds Ratios zu prüfen.
Um die zweite Hypothese zu prüfen, wurde mit Pearson-Produkt-Moment-Korrelationskoeffizienten die Beziehung zwischen den AAA-Konzentrationen im Blut und den von Eltern und Lehrern bewerteten Symptomen von ADHS untersucht. Die Größenordnung der Korrelationskoeffizienten wurde als gering (>.10), mittel (>.30) oder groß (>.50) interpretiert. Die Daten der ADHS-Gruppe und der TD-Gruppe wurden kombiniert, um die Variabilität in den ADHS-Symptommessungen zu maximieren.
Um die dritte Hypothese zu testen, wurden in der gesamten Stichprobe Korrelationsanalysen zwischen den AAA-Konzentrationen in den Blutspots und der Eiweißzufuhr sowie den AAA-Konzentrationen im Urin durchgeführt. Wir untersuchten auch, ob es Gruppenunterschiede bei der Proteinaufnahme und den AAA-Konzentrationen im Urin gab, indem wir ANOVAs mit der Gruppe (ADHS oder TD) als festen Faktor verwendeten. Schließlich wurde anhand von Korrelationsanalysen untersucht, ob die AAA-Konzentrationen im Blut mit den von den Eltern und Lehrern angegebenen Symptomen komorbider psychiatrischer Störungen zusammenhingen (Pearson-Produkt-Moment-Korrelationskoeffizienten für ODD und ASD, Spearman-Rang-Korrelationskoeffizienten für CD). Wurde ein Zusammenhang zwischen ODD-, CD- oder ASD-Symptomen und den AAA-Konzentrationen festgestellt, wurden die vorangegangenen Analysen mit diesen Symptomen als Kovariaten erneut durchgeführt. Zur Korrektur von Mehrfachtests wurde das Alpha-Niveau der Korrelationsanalysen nach dem Bonferroni-Verfahren für jeden Ergebnisbereich angepasst: ADHS-Symptome (12 Analysen, daher p = .004), potenzielle Determinanten von AAA-Anomalien in Blutflecken (12 Analysen, daher p = .004) und Symptome komorbider psychiatrischer Störungen (18 Analysen, daher p = .003). Es werden Bonferroni-bereinigte Ergebnisse berichtet.