Stammen van Streptococcus pyogenes van ernstige invasieve infecties binden HEp2- en HaCaT-cellen beter dan stammen van niet-gecompliceerde infecties | Journal of Clinical Microbiology Ernstige Invasieve Infecties binden HEp2- en HaCaT-cellen gretiger dan stammen van Ongecompliceerde Infecties

Streptococcus pyogenes (groep A streptokok) is een etiologisch agens voor diverse menselijke ziekten, waaronder faryngitis, pyodermie, en ernstige invasieve ziekten. Bovendien wordt de ziekteverwekker in verband gebracht met potentieel levensbedreigende gevolgen zoals poststreptokokkenglomerulonefritis en acute reumatische koorts. In het Northern Territory (NT) van Australië is de incidentie van acute reumatische koorts onder de inheemse bevolking zeer hoog (3), ondanks een laag keelisolatiecijfer van GAS. Bovendien komt pyodermie door GAS-infectie zeer vaak voor en is poststreptokokkenglomerulonefritis endemisch in veel afgelegen Aboriginalgemeenschappen (4, 7). Terwijl asymptomatische dragerschap van de keel vaak het gerapporteerde reservoir is voor stammen die geassocieerd worden met invasieve ziekte (5), in populaties waar impetigo endemisch is, zoals in Aboriginal gemeenschappen in de NT, is de huid het primaire reservoir. Ongeacht welk weefsel de primaire infectieplaats is, de eerste stap die de ziekteverwekker moet zetten is hechting aan gastheercellen. Het genoom van S. pyogenes codeert talrijke genen die kunnen worden beschouwd als coderend voor adhesines. Deze genen zijn sterk gereguleerd en individuele stammen hebben niet het genetisch potentieel om voor al deze eiwitten te coderen. De adhesines omvatten M-proteïne (een antiphagocytisch molecuul), capsule- en fibronectinebindende proteïnen. Er zijn veel verschillende fibronectinebindende eiwitten, zoals SfbI (8, 12), PrtF2 (9, 10), Fbp54 (2), en SfbII (11). Het adhesievermogen van een individuele stam kan variëren afhankelijk van het repertoire van genen voor de adhesines die de stam bezit en hun expressieniveau. Dit kan op zijn beurt de verschillen weerspiegelen in het vermogen tot kolonisatie en persistente infectie van verschillende weefsellocaties. Een uitvloeisel hiervan is dat isolaten van verschillende weefsellocaties verschillen kunnen vertonen in adhesievermogen. Om dit te testen, hebben we de mate van binding bepaald van GAS-isolaten uit huid, keel en bloed aan HEp2- en HaCaT-cellijnen, die respectievelijk menselijke laryngeale epitheelcellen en keratinocyten vertegenwoordigen.

GAS-isolaten uit de NT werden verzameld tussen 1990 en 2002. De 72 in deze studie geanalyseerde stammen werden geïsoleerd uit bloed (n = 26), huid (n = 22), en keel (n = 24) (tabel 1). De bloedisolaten waren afkomstig van ernstige ziekte, en de overige stammen waren afkomstig van niet-gecompliceerde infecties. De isolaten werden Vir getypeerd zoals eerder beschreven (6). Vir-typering gebeurt door middel van restrictiefragmentlengtepolymorfisme van het mga-regulon, dat het gen voor het zeer variabele M-eiwit omvat. Om ervoor te zorgen dat epidemiologisch niet-verwante stammen werden opgenomen, werd één representatief isolaat van elk Vir-type opgenomen. De culturen werden ’s nachts bij 37°C in een rondschudapparaat gekweekt tot stationaire fase in Todd-Hewitt-bouillon (Oxoid, Basingstoke, Verenigd Koninkrijk), aangevuld met 1% gistextract. Om het GAS-inoculum voor adhesietests te bereiden, werden de nachtculturen gecentrifugeerd, waarna de pellets werden gewassen in PBS (Life Technologies Gibco BRL, New York, N.Y.) en geresuspendeerd in serum- en antibioticavrij RPMI 1640-medium (Life Technologies) tot een optische dichtheid bij 600 nm van 0,05. Dit komt overeen met ongeveer 1 × 107 tot 1,5 × 107 bacteriën per ml.

Menselijke laryngeale epitheelcellen (HEp2) werden onderhouden in RPMI 1640-medium, aangevuld met 10% foetaal kalfsserum (Life Technologies), 1% Fungizone (Life Technologies), 20 μg vancomycine HCl (David Bull Laboratories, Sydney, Australië) per ml, en 100 μg streptomycinesulfaat (Sigma, St. Louis, Mo.) per ml. Keratinocyten van menselijke volwassen huid (HaCaT-cellen) werden bewaard in Dulbecco’s gemodificeerd Eagle medium (Life Technologies), aangevuld met 10% warmtegeïnactiveerd foetaal kalfsserum. Voor hechtingstests werden ∼105 cellen/ml uitgezaaid op glazen dekglaasjes met een diameter van 12 mm in de bodems van 24-wells weefselkweekplaten (Nunc, Roskilde, Denemarken). Na een nacht groeien bij 37 ° C in 5% CO2 atmosfeer, werden de cellen gewassen met PBS (pH 7,4) en geïnoculeerd met 500 ul van het GAS inoculum. Na 2 uur incubatie bij 37 ° C, werden de dekglaasjes vijf keer gewassen door het toevoegen van 1 ml PBS aan elk putje, en na voorzichtig mengen, werd de wasoplossing verwijderd door aspiratie. Na verwijdering van de niet-adherente bacteriën werden de gastheercellen en de adherente bacteriën gefixeerd met 95% methanol en aan de lucht gedroogd. Na fixatie met warmte werden de dekglaasjes op objectglaasjes geplaatst en onder olie-immersie Gram-gekleurd. In elk experiment werden cellen in verschillende willekeurige velden geanalyseerd, en de hechting werd uitgedrukt als het gemiddelde aantal GAS-ketens per cel. Alle bepalingen werden in duplo uitgevoerd, en de gemiddelde binding werd voor elke stam bepaald. Alle statistische analyses werden uitgevoerd met Stata Statistics/Data Analysis programma versie 7.0 (Stata Corporation, College Station, Tex.). De gegevens werden geanalyseerd met t-toetsen.

GAS-stammen hechtten zich aan beide celtypen, en de mate van binding varieerde van stam tot stam (tabel 1). Er was een goede correlatie tussen onafhankelijke experimenten met 20 isolaten, herhaald met twee tijdsintervallen (gegevens niet weergegeven), wat suggereert dat de aviditeit van binding reproduceerbaar en stam-specifiek is. In het algemeen is de binding van GAS aan HaCaT-cellen groter dan aan HEp2-cellen (P < 0,05). Wanneer de gegevens in tabel 1 werden gescheiden op basis van de plaats van isolatie in het weefsel, bonden gemiddeld 270 ketens van GAS-stammen uit bloed aan 50 HaCaT-cellen (fig. 1). Huid- en keelisolaten daarentegen bonden gemiddeld slechts 169 en 178 ketens per 50 HaCaT-cellen, respectievelijk. Deze verschillen zijn statistisch significant (P = 0,0044 en 0,0063, respectievelijk). Interessant is dat voor HEp2-cellen de verschillen minder uitgesproken zijn en statistisch niet significant. Toen de gegevens echter opnieuw werden geanalyseerd op basis van invasieve versus niet-gecompliceerde infecties door gegevens voor de huid- en keelisolaten te combineren, werden significante verschillen tussen de twee categorieën gevonden in beide cellijnen (P = 0,0011 voor HaCaT; P = 0,0238 voor HEp2).

Eerder werk van dit laboratorium toonde aan dat veel algemeen circulerende stammen van S. pyogenes invasieve ziekte kunnen veroorzaken met de huid als de primaire plaats van infectie (1). Deze waarnemingen zijn consistent met de huidige bevindingen van hogere aviditeit van de NT GAS-stammen voor HaCaT dan voor HEp2 cellijnen en bloedisolaten die in grotere aantallen kunnen binden dan de isolaten van ongecompliceerde infecties. Mogelijke verklaringen voor de hoge adhesie-eigenschap van S. pyogenes bloedisolaten zijn zowel genotypische als fenotypische verschillen tussen isolaten van invasieve en niet-invasieve ziektebronnen. Verdere studies zijn nodig om de aard van deze bindingsgeneigdheid te bepalen en om te bepalen of deze consistent is binnen klonale populaties.