Materialen en Methoden
Deelnemers
De proefpersonen waren 83 kinderen met ADHD (75% mannen) en 72 TD kinderen (51% mannen), in de leeftijd van 6 tot 13 jaar. Inclusiecriteria voor de ADHD groep waren: (a) een klinische diagnose van ADHD volgens de DSM-IV criteria, (b) bevestiging van deze diagnose door het Diagnostisch Interview Schema voor Kinderen, vierde editie, afgenomen bij de ouders (DISC-IV-P; ), (c) significante ADHD-symptomen, zoals aangegeven door beoordelingen van ouders >90e percentiel op ten minste een van de ADHD-schalen (aandachts- en hyperactiviteit/Impulsiviteitschalen) van de Disruptive Behaviour Disorder Rating Scale (DBDRS; ), en (d) pervasieve ADHD-symptomen, zoals aangegeven door beoordelingen van leerkrachten >75e percentiel op ten minste een van de ADHD-schalen van de DBDRS. Het hebben van een comorbide diagnose (bijvoorbeeld ODD of ASS) was geen exclusiecriterium, evenmin als behandeling met stimulerende medicatie. Kinderen die stimulerende medicatie gebruikten (N = 50, 60% van de ADHD groep) staakten het medicijngebruik 24 uur voor de test, om volledige washout mogelijk te maken, en tijdens deelname aan onze studie. Inclusiecriteria voor de TD groep waren: (a) afwezigheid van een klinische diagnose van een ontwikkelingsstoornis of gedragsstoornis (met inbegrip van ADHD en ODD), en (b) scores <90e percentiel op zowel ouder- als leerkracht-beoordelde ADHD-schalen van de DBDRS.
Materialen
Gedrag.
De ouders van kinderen die in aanmerking kwamen voor inclusie in de ADHD-groep werden beoordeeld met de disruptieve gedragsstoornis sectie van de DISC-IV-P. De DISC-IV-P is een veelgebruikt gestandaardiseerd diagnostisch interview voor de beoordeling van DSM-IV kinderpsychiatrische stoornissen, met adequate psychometrische eigenschappen.
Voorouders en leerkrachten van kinderen in zowel de ADHD- als de TD-groep vulden de DBDRS in om ADHD-symptomen en symptomen van ODD en CD te beoordelen. De DBDRS bevat vier schalen die symptomen van onoplettendheid, hyperactiviteit/impulsiviteit, ODD en CD meten op een 4-punts Likert schaal (variërend van 0 tot 3), waarbij hogere scores duiden op ergere symptomen. Adequate psychometrische eigenschappen zijn gerapporteerd voor de DBDRS.
De Strengths and Weaknesses of ADHD-symptoms and Normal Behaviour rating scale (SWAN; ) is ingevuld door ouders en leerkrachten om symptomen van ADHD te beoordelen. Deze veelgebruikte vragenlijst bevat twee subschalen; de Inattentieschaal en de Hyperactiviteit/Impulsiviteitschaal, elk bestaande uit 9 items. De items worden gescoord op een 7-punts Likert schaal (variërend van -3 tot +3), waarbij hogere scores duiden op ergere symptomen. De items zijn gebaseerd op de DSM-IV symptomen van ADHD, maar weerspiegelen beide uiteinden (sterk en zwak) van het gedrag beschreven in elk ADHD symptoom. De gemiddelde scores op beide subschalen werden gebruikt als afhankelijke variabelen. Adequate psychometrische eigenschappen zijn gerapporteerd voor de SWAN.
ASD-symptomen werden beoordeeld met behulp van de 65-item Social Responsiveness Scale (SRS; ), ingevuld door ouders en leerkrachten. De items van de SRS zijn gebaseerd op de DSM-IV symptoomdomeinen van ASS, waaronder stoornissen in de sociale interactie, communicatieve tekorten en beperkte/stereotiepe gedragspatronen of interesses. De SRS gebruikt een 4-punts Likert schaal (variërend van 0 tot 3), en de gesommeerde item score op de totale SRS schaal werd gebruikt als afhankelijke maat, waarbij hogere scores duiden op slechtere symptomen. De SRS heeft adequate psychometrische eigenschappen.
Bloedspots.
Om de bloedconcentraties van tryptofaan, tyrosine en fenylalanine te onderzoeken, werd gebruik gemaakt van een gedroogde bloedspottechniek. Het verzamelen van bloedvlekken is voor kinderen minder invasief dan het nemen van veneuze bloedmonsters en de droge bloedvlektechniek is voldoende robuust en stabiel voor diagnostische doeleinden . Bloed spot AAA concentraties zijn sterk gecorreleerd met serum AAA concentraties (rs variërend van .86 tot .96) . Van elk kind werd een bloedvlek verzameld met behulp van een wegwerp veiligheidslancet. Drie bloeddruppels werden op een bloedvlekkaart gespot. Een 5,5 mm pons van een gedroogde bloedvlek werd gemengd met 100 μl van een interne standaardoplossing (die 29 μM L-fenylalanine-D5, 6 μM L-tyrosine-D4 en 5 μM L-tryptofaan-D5 bevat) en 400 μl methanol in een gaschromatografieflacon (GC-flacon) en gedurende 15 minuten geschud in een ultrasoon bad. Het supernatans werd overgebracht in een ander GC-flesje en verdampt onder stikstof bij 30 °C. Vervolgens werd het monster gebutyleerd met 100 μl 5,5% acetylchloride (in n-butanol) bij 60°C gedurende 15 minuten. Daarna werd de butanollaag verdampt onder stikstof (bij 30°C) en werd het residu opgelost in 500 μl acetonitril. Bloedvlekconcentraties van tryptofaan, tyrosine en fenylalanine werden bepaald door positieve elektrospray vloeistofchromatografie-tandem massaspectrometrie (LC-MS/MS), met behulp van een API 3000 triple quadrupool massaspectrometer (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA), gekoppeld aan een hogedrukvloeistofchromatografiesysteem (HPLC) (Perkin Elmer Series 200, Shelton, USA). Drie μl van het monster werd geïnjecteerd op een symmetrie C18 kolom (3.9*150mm, 5μm; Waters, Milford, MA, USA) en geëlueerd met een debiet van 1ml/min van 75% acetonitril (met 0.4% mierenzuur). Tryptofaan, tyrosine en fenylalanine elueerden binnen 1 minuut en werden gemeten met de volgende overgangen: massa/ladingsverhouding (m/z) 261.2→159.2 (tryptofaan), m/z 238.2→136.2 (tyrosine) en m/z 222.2→120.2 (fenylalanine). Alle verkregen LC-MS/MS-gegevens werden verkregen en verwerkt met behulp van Analyst 1.4.2-software (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). De bloedvlekconcentraties van tryptofaan, tyrosine en fenylalanine werden uitgedrukt in μmole/L. Betrouwbaarheid van de LC-MS/MS werd bevestigd door het onderzoeken van de inter-assay variantie (5-10%), intra-assay variantie (8-10%) en recovery (90-112%).
Dieet eiwitinname.
Dagelijkse eiwitinname werd gedurende drie dagen beoordeeld, met behulp van een door de ouders gerapporteerd voedingsdagboek. Gestandaardiseerde voedingsregistraties en instructies werden verstrekt. De ouders werden geïnstrueerd om alle geconsumeerde voedingsmiddelen en dranken in het voedingsdagboek te registreren en de geconsumeerde hoeveelheden zo nauwkeurig mogelijk uit te drukken. De hoeveelheid eiwitinname (gram/dag) werd berekend op basis van een gecomputeriseerde versie van de Nederlandse voedselsamenstellingsdatabase. De Nederlandse voedselsamenstellingsdatabase bevat meer dan 2000 voedingsproducten met informatie over de voedingssamenstelling van deze voedingsproducten. De database wordt op grote schaal gebruikt voor wetenschappelijke doeleinden (bijv.).
Urine.
Om de concentraties AAA in de urine te onderzoeken, verzamelden de deelnemers alle urine die binnen 18 opeenvolgende uren (na schooltijd) werd uitgescheiden in een urineverzamelcontainer. Tijdens het verzamelen van de urine werd de container bewaard in een koelkast (<5°C). Een monster van 10 ml werd naar een laboratorium gestuurd voor analyse, waar het monster werd bewaard bij -20°C. Een HPLC techniek met fluorescentie detectie werd gebruikt voor de analyse van tryptofaan in urine. De concentraties van tyrosine en fenylalanine in de urine werden bepaald met behulp van een Biochrom aminozuuranalysator. De urineconcentraties van tryptofaan, tyrosine en fenylalanine werden uitgedrukt in een μmole-totaal urinevolume ratio, om effecten van polyurie of oligurie uit te sluiten. De betrouwbaarheid van de HPLC-techniek werd bevestigd door de precisie van de analyses te onderzoeken; deze bedroeg 2,25% voor tryptofaan (relatieve standaardafwijking), en 1,50% voor tyrosine en fenylalanine. Er zijn hoge correlaties tussen de aminozuurconcentraties in 12-uursmonsters en 24-uursmonsters, hetgeen aangeeft dat er geen dag-tot-dagvariatie is in de uitscheiding van aminozuren, hetgeen het gebruik van een 18-uursmonster in de huidige studie valideert.
Procedure
Deze studie werd goedgekeurd door de lokale medisch ethische commissie van het VU Medisch Centrum Amsterdam, Nederland (#NL39922.029.12), en werd uitgevoerd in overeenstemming met de ethische normen zoals vastgelegd in de Verklaring van Helsinki van 1964 en de latere wijzigingen. Schriftelijke geïnformeerde toestemming werd verkregen van de ouders van alle kinderen, en van kinderen ≥12 jaar, voorafgaand aan deelname. Kinderen met ADHD werden gerekruteerd uit de geestelijke gezondheidszorg poliklinieken, via de oudervereniging voor kinderen met gedragsproblemen, en via een universitaire onderzoek website. De TD groep werd gerekruteerd uit basisscholen verspreid over het hele land. Kinderen die stimulerende medicatie gebruikten, staakten het medicijngebruik één dag voor de deelname (dag 0), om een volledige uitwas te verzekeren, en tijdens de beoordeling van bloed-, urine- en voedselinname (dag 1 tot dag 3). Op dag 1 werd het bloed vroeg in de ochtend afgenomen, om de effecten van de dagelijkse variatie van de bloed AAA concentraties uit te sluiten. Dezelfde dag, na schooltijd, werd begonnen met het opvangen van de urine en dit ging door gedurende de volgende 18 uur, totdat het kind de volgende ochtend weer naar school zou gaan (dag 2). In de vroege ochtend van dag 1 ontvingen de ouders gedetailleerde instructies over het invullen van het voedingsdossier en het verzamelen van de urine van hun kind. Na de instructie begonnen de ouders met het noteren van de voedingsinname van hun kind, wat de volgende drie dagen (dag 1 tot dag 3) werd voortgezet. Ouders en leerkrachten werden uitgenodigd om de vragenlijsten in te vullen op een beveiligde website. Alle gegevens werden verzameld tussen februari 2013 en juli 2014. De ADHD- en TD-groep werden gelijktijdig gerekruteerd, om te controleren op mogelijke seizoensgebonden effecten op voedselinname of AAA-metabolisme.
Data-analyse
Alle statistische analyses werden uitgevoerd met behulp van R, versie 3.2.1. Alle variabelen werden geïnspecteerd op uitbijters en ontbrekende waarden voor de ADHD en TD groep afzonderlijk. Winsorising werd toegepast op uitbijters, deze werden vervangen door een waarde een eenheid groter (of kleiner) dan de vorige meest extreme score in de verdeling van de groep. Ontbrekende gegevens in de urineconcentraties, de voedingsgegevens en de gedragsgegevens werden willekeurig verdeeld en vervangen door groepsgemiddelden. Voor de bloedvlekken waren er geen ontbrekende gegevens. Alle gegevens waren normaal verdeeld, behalve de CD-symptomen. Groepsverschillen in geslacht werden onderzocht met een chi-kwadraat toets, en groepsverschillen in leeftijd en gedragsfunctioneren werden onderzocht met onafhankelijke steekproeven t-toetsen.
Om de eerste hypothese te testen, werden groepsverschillen in AAA bloedvlekconcentraties beoordeeld met behulp van Analyses van Varianties (ANOVA’s) met groep (ADHD of TD) als vaste factor. Effect sizes werden berekend in termen van partial eta squared, en geïnterpreteerd als klein (> .01), middelgroot (>.06) of groot (>.14) . Bovendien werden odds ratio’s berekend, die het risico uitdrukten om gediagnosticeerd te worden met ADHD bij benedengemiddelde AAA concentraties. Normatieve gegevens voor AAA concentraties werden ontleend aan een grote steekproef van 6 tot 13 jaar oude kinderen (N = 104, 52% mannen) (ongepubliceerde gegevens, steekproefinformatie en resultaten verkrijgbaar bij de auteurs). Voor elk AAA werden concentraties die overeenkwamen met het laagste 16e percentiel (M-1 SD) van de normatieve steekproef gebruikt als drempelwaarde om benedengemiddelde AAA-concentraties te definiëren (voor tryptofaan 45 μmole/L, tyrosine 39 μmole/L, en fenylalanine 47 μmole/L). Odds ratio’s werden berekend met hun 95% betrouwbaarheidsinterval en Fisher’s Exact Test werd uitgevoerd om de significantie van de odds ratio’s te onderzoeken.
Om de tweede hypothese te testen, onderzochten Pearson product-moment correlatiecoëfficiënten de relatie tussen bloedvlek AAA concentraties en zowel door ouders als leerkrachten beoordeelde symptomen van ADHD. De grootte van correlatiecoëfficiënten werd geïnterpreteerd als klein (>.10), middelgroot (>.30) of groot (>.50) . Gegevens van de ADHD groep en TD groep werden gecombineerd om de variabiliteit in de ADHD symptoom metingen te maximaliseren.
Om de derde hypothese te testen, werden correlatie analyses tussen bloedvlek AAA concentraties en eiwit inname en urine AAA concentraties uitgevoerd in de gehele steekproef. We onderzochten ook of er groepsverschillen waren in eiwitinname en urine AAA concentraties met behulp van ANOVA’s met groep (ADHD of TD) als vaste factor. Tenslotte evalueerden correlationele analyses of bloedvlek AAA concentraties gerelateerd waren aan door ouders en leerkrachten gerapporteerde symptomen van comorbide psychiatrische stoornissen (Pearson product-moment correlatie coëfficiënten voor ODD en ASS, Spearman’s rang correlatie coëfficiënten voor CD). Indien symptomen van ODD, CD of ASS gerelateerd werden bevonden aan de AAA concentraties, werden voorgaande analyses opnieuw uitgevoerd met deze symptomen ingevoerd als covariaten. Om te corrigeren voor meervoudig testen werd het alpha niveau van de correlatie analyses aangepast volgens de Bonferroni procedure per uitkomstdomein; ADHD symptomen (12 analyses, dus p = .004), potentiële determinanten van AAA afwijkingen in bloedvlekken (12 analyses, dus p = .004), en symptomen van comorbide psychiatrische stoornissen (18 analyses, dus p = .003). Bonferroni gecorrigeerde resultaten worden gerapporteerd.