Het kopiegetal van gemethyleerd O6-Methylguanine-DNA-methyltransferase (MGMT) wordt bepaald ten opzichte van het kopiegetal van beta-actine (ACTB) door middel van real-time methyleringsspecifieke polymerasekettingreactie (MSP). Daartoe wordt het tumorweefsel verrijkt door manuele microdissectie gevolgd door DNA-extractie. Het DNA wordt gekwantificeerd met Picogreen en gemodificeerd door bisulfietbehandeling waardoor niet-gemethyleerde cytosines worden omgezet in uracyl terwijl gemethyleerde cytosines onveranderd blijven. Vervolgens wordt een real-time Methylation Specific PCR (MSP) uitgevoerd op het Quantstudio 5-instrument om het kopiegetal van MGMT en ACTB te kwantificeren (1). Deze techniek bestaat uit het uitvoeren van een PCR met real-time detectie met behulp van het amplifluor-detectiesysteem. Monsters met een onbekend kopiegetal kunnen worden gekwantificeerd door vergelijking van hun Ct-waarden met die van een plasmide-standaardcurve.
Clinical Implication
MGMT is een DNA-reparatie-enzym dat bij menselijke kanker vaak door hypermethylering wordt gedeactiveerd. Wanneer cellen geen MGMT-activiteit hebben, wordt DNA-schade niet goed gerepareerd, waardoor een individu vatbaarder is voor de ontwikkeling van kanker. Interessant is dat dit gebrek aan MGMT-activiteit een tumorcel ook gevoeliger maakt voor bestralingstherapie en bepaalde alkylerende geneesmiddelen zoals temozolomide (2). In de internationale prognostische fase III-validatiestudie (RTOG 0525) identificeerde de MGMT-assay met succes nieuw gediagnosticeerde glioblastoma-patiënten bij wie de kans groter is dat ze langer leven en een langere progressievrije periode hebben na behandeling met temozolomide (3-5). Onlangs werd een nieuwe publicatie gepubliceerd waarin zowel gemethyleerde als “grijze zone” patiënten significant beter presteerden voor algehele overleving dan echt ongemethyleerde patiënten (6).
Specimenvereisten
Acceptabele specimens voor de assay zijn formaline-vaste, paraffine-embedded glioma-weefselspecimens met een fixatietijd van 6-48 uur.
Volume
Eén representatief paraffineblok heeft de voorkeur. Als alternatief worden 5 niet-gekleurde weefseldoorsneden geaccepteerd (1 objectglaasje van 5 µm dikte voor H&E-kleuring en minimaal 4 objectglaasjes van 5-10 µm dikte voor MGMT-tests).
Instructies voor opslag en verzending
Bewaar en verzend de specimens bij omgevingstemperatuur.
Beperkingen
Voor sommige monsters zal een ongeldig resultaat worden verkregen als gevolg van een onvoldoende aantal ACTB-kopieën in combinatie met een aantal MGMT-kopieën onder de aantoonbaarheidsgrens. Meestal wordt dit verklaard door onvoldoende DNA-hoeveelheid en/of -kwaliteit. Voor ongeldige monsters met een kopiegetal voor MGMT en/of ACTB rond de LOD/LOQ en de cut-off, wordt aanbevolen een hertest uit te voeren uitgaande van het met bisulfiet behandelde DNA. Andere fixeermiddelen dan formaline of een langere fixatietijd kunnen aanleiding geven tot ontoereikende resultaten.
Speciale vereisten
Neen
Terugverdientijd
Vijf tot zeven werkdagen voor respectievelijk objectglaasjes en paraffineblokken.
- Vlassenbroeck I et al. Validation of Real-Time Methylation-Specific PCR to determine O6-Methylguanine-DNA Methyltransferase Gene Promotor Methylation in Glioma. J Mol Diagn. 2008 Jul;10(4):332-7
- Hegi ME et al. MGMT gene silencing and benefit from temozolomide in glioblastoma. N Engl J Med 2005 Mar 10;352(10):997-1003.
- Gilbert MR et al. Dose-gedoseerd temozolomide voor nieuw gediagnosticeerd glioblastoom: een gerandomiseerde fase III klinische trial.(7). J Clin Oncol. 2013 Nov 10;31(32):4085-91.
- Malmström A et al. Temozolomide versus standaard 6-weekse radiotherapie versus hypofractioneerde radiotherapie bij patiënten ouder dan 60 jaar met glioblastoom: de Scandinavische gerandomiseerde, fase 3-studie. Lancet Oncol 2012 Sep; 13(9): 916-926.
- Wick W et al. Temozolomide chemotherapie alleen versus radiotherapie alleen voor maligne astrocytomen bij ouderen: de NOA-08 gerandomiseerde, fase 3 trial. Lancet Oncol 2012 Jul; 13(7): 707-715.
- Hegi ME et al. MGMT Promoter Methylation Cutoff with Safety Margin for Selecting Glioblastoma Patients into Trials Omitting Temozolomide. Een gepoolde analyse van vier klinische trials. Clin Cancer Res 2019 Mar 15; 25(6): 1809-1816.
Updated on 23 May 2019