Mechanisme van synergistische actine filament spits eind depolymerisatie door cyclase-geassocieerd eiwit en cofiline

DNA constructen

Alle muis N-CAP eiwitten, N-CAP-GFP, full-length CAP1, het HFD domein, GST-fusie van het HFD domein en de C-terminale ADF-H domein van twinfilin, werden gekloond in pSUMOck4 bacteriële expressie vector (een soort geschenk van Inari Kursula, Universiteit van Bergen, Noorwegen) tot een SUMO-tagged fusie-eiwit dat een natieve N-terminus laat na splitsing met SENP2 protease uit te drukken. Voor de CARP domein en C-CAP constructen, gebruikten we pCoofy18 bacteriële expressie vector (een soort geschenk van Addgene). Voor details van de proteïne constructen en primers gebruikt voor het klonen van de constructen, zie aanvullende tabel 2.

Expressie en zuivering CAP-eiwitten en zijn fragmenten

Alle muis CAP-eiwitten en zijn fragmenten, met uitzondering van full-length CAP1, werden uitgedrukt bij +22 ° C in LB auto-inductie media (AIMLB0210, Formedium) gedurende 24 uur in BL21 (DE3) E. coli (van Novagen).

Full-length muis CAP1 werd uitgedrukt in LB-medium met behulp van ArcticExpress (DE3) E. coli cellen. Eerst inoculeerden we een startercultuur met kanamycine (20 µg/ml) en gentamycine (20 µg/ml) die gedurende 6 uur bij +37 °C werd geïncubeerd. De hoofdkweek van 3,6 l, die alleen kanamycine (20 µg/ml) bevatte, werd geënt en gekweekt tot OD600 van ~0,4 bij +37 °C, geschud bij 240 omwentelingen per minuut. De kweektemperatuur werd gewijzigd in +13 ° C gedurende 1 uur voorafgaand aan eiwitexpressie die werd geïnduceerd door toevoeging van 0,26 mM IPTG gedurende 46 uur. Alle bacteriële pellets werden verzameld door centrifugatie, geresuspendeerd in 50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 25 mM imidazol, pH 7,5, snap-frozen met vloeibare N2 en opgeslagen bij -80 ° C.

Alle CAP-eiwitten en het ADF-H domein van twinfilin werden gezuiverd met behulp van een vergelijkbare workflow. Eerst werden bacteriën gelyseerd door sonicatie in aanwezigheid van lysozym (0,5 mg/ml), DNAse (0,1 mg/ml) en proteaseremmers (200 µg/ml PMSF, 1 µg/ml leupeptine, 1 µg/ml aprotinine, 1 µg/ml pepstatine A; alle van Sigma-Aldrich), en het lysaat werd opgehelderd door centrifugatie. Het supernatant werd in een 1 ml HisTrap HP Ni-NTA kolom (GE Healthcare) geladen en uitvoerig gewassen (>20 kolomvolumes) met 50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 25 mM imidazol, pH 7,5. Eiwit werd geëlueerd met een 25-250 mM imidazol gradiënt op de AKTA Pure machine (GE Healthcare). Piekfracties werden samengevoegd en SENP2 protease werd toegevoegd aan de uiteindelijke concentratie van 40 µg/ml voor verwijdering van de SUMO-tag. Mengsel werd gedialyseerd O / N bij 4 ° C met SnakeSkin dialyse buizen in 1 l van 20 mM HEPES, 300 mM NaCl, 2 mM DTT, pH 7,4 buffer. De volgende dag werden de gesplitste SUMO-tags verwijderd met Ni-NTA agarose korrels (Qiagen) in gevallen waarin de SUMO-tag en gesplitst eiwit waren gelijk in grootte. Eiwitten werden geconcentreerd met Amicon Ultra-4 10 kDa centrifugaal filter (Merck) en geladen in HiLoad 16/600 Superdex 200 gel filtratie kolom (GE Healthcare), geëquilibreerd in 5 mM HEPES, 100 mM NaCl, 1 mM DTT, pH 7,4. Piekfracties werden verzameld, geconcentreerd, en bevroren door snap-vriezen in N2 voor -80 ° C storage.

De full-length CAP werd gezuiverd met de volgende uitzonderingen. We gebruikten een 5 ml HisTrap HP Ni-NTA kolom in plaats van 1 ml kolom. Na dialyse en gelfiltratie met HiLoad 16/60 Superdex 200 gelfiltratiekolom werden de belangrijkste piekfracties door Superose 6 increase 10/300 GL gelfiltratiekolom geleid om een betere scheiding van het mengsel van oligomere toestanden te verkrijgen. Tenslotte werden de belangrijkste pieken uit verschillende runs gecombineerd, geconcentreerd bij 5-min centrifuge-intervallen met Amicon Ultra-4 30 kDa centrifugaalfilter, en opgeslagen zoals hierboven. CARP en C-CAP eiwitten werden gezuiverd als hierboven met uitzondering van het gebruik van 3C protease (0,01 mg / ml) voor tag splitsing.

Andere eiwitten

Rabbit spieractine, gelabelde actines, profiline, muis cofiline-1, aftopping eiwit, en biotine-gelsolin werden bereid zoals beschreven in ref. 16. ADP-actine werd bereid zoals beschreven in ref. 34. Kortom, 30 µM ATP-G-actine oplossing met 0,3 mM glucose en 1 eenheid / ml hexokinase (Sigma) werd gedialyseerd tegen nucleotide uitwisseling buffer (5 mM Tris-HCl, 0,1 mM MgCl2, 0,05 mM EGTA, 0,2 mM ADP, 1 mM DTT, pH 8,0) gedurende 4 uur bij 4 ° C. Alle experimenten werden uitgevoerd met konijn spier α-actine.

Actine spitse uiteinde depolymerisatie assays

Meting van de actine filament spitse uiteinde depolymerisatie snelheid werd uitgevoerd met behulp van een microfluïdica-apparaat gekoppeld aan een microscopie setup, zoals beschreven16. In het kort, bereidden we een kamer met poly dimethyl siloxaan (PDMS, Sylgard), die werd gemonteerd op een gereinigd dekglaasje. De microfluïdische kamers waren 20 µm hoog. De drie inlaten en de uitlaat waren verbonden met drukgeregelde buizen gevuld met oplossingen van verschillende biochemische samenstelling (Fluigent microfluïdica-apparaat).

Na montage werden de kamers gespoeld met dH20 en F-buffer (5 mM HEPES pH 7,4, 100 mM KCl, 1 mM MgCl2, 0,2 mM EGTA, 0,4 mM CaCl2, 0,2 mM ATP, 10 mM DTT en 1 mM DABCO). De kamer werd vervolgens achtereenvolgens blootgesteld aan: 150 µl van 0,1% biotine-BSA in F-buffer; 300 µl van 5% BSA; 150 µl van 3 µg/ml neutravidine in F-buffer; en 10-100 µl van 1-3 pM biotine-gelsolin. Voorafgaand aan de experimenten, werden actine filamenten gepolymeriseerd (8 µM, >30 min) in F-buffer. Een fractie van actine monomeren werd gelabeld met Alexa-488 of 568. Filamenten werden uiteindelijk geïnjecteerd in de kamer en verankerd aan het dekglaasje door de gelsolines tot de gewenste dichtheid.

Om de depolymerisatiesnelheid van cofiline-versierde spitse uiteinden te meten, werden filamenten eerst verzadigd met 2 µM cofiline, en blootgesteld aan 2 µM cofiline aangevuld met verschillende CAP-eiwitten. De depolymerisatiesnelheid werd geanalyseerd met ImageJ, waarbij eerst voor elk filament een kymograaf werd gemaakt (functie reslice) en handmatig een helling langs het spitse uiteinde werd aangebracht. Filamenten, die spitse uiteinden niet duidelijk kon worden gevolgd of had mogelijke (on)waargenomen pauzes53 of verbreken gebeurtenissen werden verwijderd uit analyse.

Om het effect van eiwit label op onze metingen te minimaliseren, gebruikten we 10% of 16% labeling fractie van actine, afhankelijk van de microscopie setup. We hebben niet waargenomen effecten van labeling fractie voor N-CAP activiteit in onze experimenten. Alle experimenten werden uitgevoerd bij kamertemperatuur, in niet-temperatuur-gecontroleerde setup.

Reannealing van actine filamenten

Voorgevormde, steady-state F-actine oplossingen (in F-buffer) met verschillende fluorescerende labels werden gemengd en geïncubeerd om reannealing kwantificeren. De gemengde oplossing bevatte 4 µM van Alexa568-actine (10% gelabeld) en 4 µM van Alexa488-actine (10% gelabeld), met of zonder N-CAP en mutanten. Na 4 min. bij kamertemperatuur werd de gemengde F-actine oplossing verdund 100× in buffer aangevuld met 0,2% methylcellulose, en stroomde in een open kamer gemaakt met dubbelzijdig tape ingeklemd tussen twee dekglaasjes, en gepassiveerd met BSA. Beeldreeksen (2 s interval) werden verkregen in ten minste drie verschillende gezichtsvelden. Het aantal groene (Alexa488) F-actine segmenten werden geteld, alsmede het aantal van deze segmenten die waren verbonden met een rode (Alexa568) F-actine segment, om de verhouding van twee kleuren segmenten uitgezet in Fig. 2f te bepalen. Door de diffusie van de filamenten te volgen, konden we ondubbelzinnig bepalen wanneer twee segmenten verbonden waren. Controles (zonder N-CAP in het F-actinemengsel) werden verschillende keren herhaald, en experimenten (met N-CAP of mutanten) ten minste twee keer.

Actine severing assays

Om de impact van N-CAP op de verbreking door cofiline te onderzoeken, gebruikten we twee verschillende methoden, hetzij (1) door het meten van de fractie van enkele cofiline domeinen die nog niet hebben geleid tot een verbreking of door (2) het kwantificeren van het globale aantal verbreking gebeurtenissen per µm van actine filament.

(1) Verbreking geassocieerd met enkele cofiline domeinen (Supplementary Fig. 3c). We volgden de procedure eerder beschreven16. Kort gezegd, in een microfluïdische kamer, werden 12% Alexa-488 gelabelde actine filamenten gepolymeriseerd van spectrine-actine zaden, verankerd niet-specifiek op een BSA gepassiveerde dekglaasje. Filamenten werden verouderd gedurende 15 min met een oplossing van G-actine bij kritische concentratie (100 nM G-actine), zodat filamenten worden > 99% ADP46. Filamenten werden vervolgens continu blootgesteld aan 500 nM mCherry-cofilin-1 alleen, met 2 µM full-length CAP1 of met 10 µM N-CAP. Op ImageJ, werden kymographs van de filamenten vervolgens geconstrueerd om de kernen en de assemblage van enkele cofiline domeinen en het verbreken van gebeurtenissen op de interface met kale actine segmenten te volgen.

Voor elk domein, werd tijd 0 gedefinieerd op het frame waarop ze gekiemd. Vervolgens hebben we ofwel de tijd waarop zij een verbreken evenement geïnduceerd, of wanneer ze verloren als gevolg van verbreken door een ander domein, samenvoegen, of censoring gebeurtenis. De fractie van domeinen die niet hebben geïnduceerd een scheurende gebeurtenis werd vervolgens berekend met behulp van een klassieke Kaplan-Meier methode.

(2) Totaal aantal scheidende gebeurtenissen / cm (Supplementary Fig. 3d). Binnen stroom kamers (tussen twee dekglaasjes uit elkaar door dubbelzijdige tape, hebben we eerst geïnjecteerd gepolymeriseerde Alexa-488 gelabelde filamenten (in F-buffer, met 0,2-0,3% Methylcellulose). De oplossing werd vervolgens uitgewisseld met 500 nM ongelabelde cofilin-1 en 0, 1 of 10 µM NCAP. Na de uitwisseling werden de filamenten die dicht bij het oppervlak bleven als volgt geanalyseerd.

Het aantal scheidingsgebeurtenissen per µm werd berekend als de cumulatieve functie

waar Nsev(u) het aantal scheidingsgebeurtenissen op tijdstip u is, en \(\mathop {sum}\nolimits_i {l_{i(u)}}) de som over alle filamenten i van hun lengte op tijdstip u. Aangezien de oplossing geen G-actine bevat, depolymeriseren de filamenten, en de filamentlengte neemt dus af in de tijd.

Binding van N-CAP aan filamenten spitse uiteinden

Het experiment werd uitgevoerd in flow-chambers (zie Actin severing assay (2)), gepassiveerd met biotine-PLL-PEG en gefunctionaliseerd met neutravidine. F-actine (10% Alexa-568, 1% biotine) werd ’s nachts gepolymeriseerd bij 4 µM. Vlak voor injectie in de kamer, werd F-actine verdund tot 200 nM en gemengd met 100 nM N-CAP-GFP, 2 µM cofiline-1, en 4 nM capping eiwit, in F-buffer aangevuld met 0,2% methylcellulose. Beelden van actine filamenten werden verkregen voor en na een stream overname van het GFP-kanaal (5 frames / seconde gedurende 12 s, TIRF microscopie). Voor de analyse van binding aan de filamentuiteinden, werden actine filamenten die niet bewogen tijdens de stream acquisitie blind geselecteerd. De fluorescentie werd gemeten aan de twee uiteinden van elk filament, op een 3 bij 3 pixels gebied. Een bindingsgebeurtenis werd gedetecteerd wanneer de fluorescentie over een arbitraire drempelwaarde zou gaan (zelfde waarde voor alle filamenten en filamentuiteinden). Aangezien het afdekeiwit het uiteinde met weerhaakjes moet beschermen, werd het puntige uiteinde toegeschreven aan het uiteinde met de meeste bindingsgebeurtenissen. N-CAP-GFP werd gedetecteerd in 17% van de datapunten aan het spitse uiteinde van het filament, terwijl aspecifieke associatie van N-CAP-GFP in de nabijheid van het weerhaakse uiteinde van het filament werd gedetecteerd in 1,7% van de datapunten. De overlevingsfractie van N-CAP aan het spitse uiteinde werd vervolgens berekend en gemonteerd met een enkele exponentiële om de onbindingssnelheid te meten.

Kristallisatie en structuurbepaling

Het muis HFD-domein werd gekristalliseerd met 10×His-tag aanwezig, en gezuiverd zoals hierboven beschreven, met uitzondering van het gebruik van 5 mM HEPES, 50 mM NaCl, 0,2 mM DTT, 0,01% NaN3, pH 7,5 buffer bij gelfiltratie. Het monster werd vóór de kristallisatie geconcentreerd tot 7-10 mg/ml en 1:1 gemengd met 0,1 M natriumcacodylaat, 12% PEG4000 (w/v), pH 6,1 met behulp van een zittende druppelmethode met een druppelgrootte van 200 nl in 96-well-formaat. Na 2 weken incubatie werden grote naaldvormige kristallen waargenomen. Voor het verzamelen van gegevens op afstand bij Diamond Light Source (UK, Didgot) op beamline I03 werden de kristallen cryo-beschermd door onderdompeling in moedervloeistof met 25% glycerol en ingevroren in N2 voor verzending naar de beamline. De gegevens werden verzameld bij 100 K met een golflengte van 0,9763 Å, Pilatus3 6M detector, 30% transmissievermogen, 0,05 s belichting en 0,1° oscillatiehoek in een totaal van 2400 frames. De diffractiegegevens werden geïntegreerd en geschaald met X-ray Detector Software (XDS)54. De initiële oplossing werd verkregen met moleculaire vervanging met behulp van PHASER55 en PDB = 1s0p als zoekmodel. Er werd een oplossing gevonden met vier HFD-domeinen in een asymmetrische eenheid, waarna meerdere verfijningsrondes met BUSTER56 en handmatig bouwen in COOT57 een goede fit met de gegevens opleverden (zie tabel 1). Verdere verbetering werd verkregen door de gegevens te verfijnen met de introductie van translatie-liberatie-schroefparameters (1/keten), verwijdering van niet-kristallografische restricties en modellering van individuele atomaire B-factoren. De uiteindelijke Rwork/Rfree voor het model was 18,6%/23,0% met een goede algemene geometrie.

Voor de kristallisatie van het tripartiete complex (van ADP-actine, HFD domein van muis CAP1, en C-terminale ADF-H domein van muis twinfilin-1), werd ADP-actine geprepareerd in O/N dialyse bij +4 °C in 5 mM HEPES, 0.2 mM MgCl2, 0,2 mM ADP, 0,2 mM EGTA, 0,3 mM glucose, 0,5 mM β-mercaptoethanol, pH 8,0. Actine oplossing, met 0,3 mM glucose en 5 U / ml hexokinase, werd overgebracht naar een Slide-A-Lyser dialyse membraan en op een floater apparaat bij +4 ° C. De volgende dag voor de complexvorming werd actine gedurende 20 min. bij 355.040 × g gecentrifugeerd met de TLA-120 rotor. Eiwitten werden gemengd in 1:1,1:1,1 verhouding (actine, HFD domein, ADF-H domein), geconcentreerd tot 10-20 mg / ml en gebruikt voor kristallisatie als hierboven. Hits werden verkregen uit verschillende omstandigheden, en de beste diffracting kristal werd verkregen op ~ 10 mg / ml concentratie van het complex gemengd 1:1 in 0,1 M HEPES, 0,1 mM KCl, 10% PEG4000 (w / v), pH 7,0 met zittende druppelgrootte van 200 nl. Op de eerste dag verschenen verscheidene kleine ruitvormige kristallen in de druppel. Op de derde dag verscheen een groot staafvormig kristal terwijl alle kleine kristallen waren opgelost. Voor het verzamelen van gegevens op afstand bij Diamond Light Source (UK, Didgot) op beamline I03, werden de kristallen cryo-beschermd door onderdompeling in LV CryoOil (MiTeGen) en snap-frozen in N 2 voor verzending. De gegevens werden verzameld bij 100 K met behulp van 0,9762 Å golflengte, Pilatus3 6M detector, 20% transmissievermogen, 0,05 s blootstelling en 0,15 ° oscillatiehoek als een totaal van 2400 frames. De diffractiegegevens werden geïntegreerd en geschaald met XDS54. Een eerste oplossing werd verkregen met moleculaire vervanging met behulp van PHASER55 en PDB = 3daw als zoekmodel dat een duidelijke extra dichtheid liet zien in het spitse uiteinde van actine monomeer. Aldus werd een nieuwe moleculaire vervanging uitgevoerd, en een eerste model voor het tripartiete complex werd verkregen met BALBES58 met 3daw en 1s0p als zoekmodellen. Dit leverde een oplossing op met Q = 0,787 en Rwork/Rfree = 29,7%/35,6%. De asymmetrische eenheid bevatte een enkel 1:1:1 complex van HFD:ADF-H:ADP-actine. Meerdere verfijningsrondes met BUSTER56 en handmatig bouwen in COOT57, met name het opnieuw opbouwen van de D-lus en de verbindingslussen van α-helften in het HFD-domein waren nodig om het model te verbeteren. Tenslotte leverden de toevoeging van water, de introductie van translatie-libratie-schroef parameters (1/keten), en individuele atomaire B-factor modellering een model op met een uiteindelijke Rwork/Rfree van 16.6%/19.4% met een goede algemene geometrie.

Onderzoeken van eiwit-eiwit interacties door gel filtratie

Voor het bestuderen van actine monomeer binding, werd ADP-G-actine bereid zoals beschreven in ref. 34. Alle gel filtratie experimenten werden uitgevoerd bij + 4 ° C met 0,5 ml / min loopsnelheid en 0,5 ml fractionering met Superdex 200 verhoging 10/300 GL gel filtratie kolom, geëquilibreerd in 5 mM HEPES, 100 mM NaCl, 0,1 mM ADP, 0,1 mM MgCl2, 1 mM DTT, pH 7,4. Honderd microliter complex met 18 µM ADF-H domein van twinfilin, 15 µM andere eiwitten werd op de kolom geïnjecteerd en geanalyseerd op elutie. De piekfracties werden ook geanalyseerd met SDS-PAGE. Actinemonomeercompetitie-experimenten werden uitgevoerd zoals hierboven, door 15 µM C-CAP of CARP-domein aan de monsters toe te voegen. Piekfracties werden geanalyseerd op SDS-PAGE, gels werden belicht met ChemiDoc XRS + imaging systeem (Bio-Rad), en gekwantificeerd met Image Lab (Bio-Rad).

Native-PAGE

Mini-Protean TGX 10% gels (Bio-Rad) werden vooraf in gekoelde loopbuffer (25 mM Tris, 195 mM glycine, 0,5 mM ADP, 0,1 mM MgCl2, pH 8,5) gedurende 1 uur voor het laden uitgevoerd. De monsters werden bereid in ADP-actine dialysebuffer (5 mM HEPES of Tris, 0,1 mM MgCl2, 0,1 mM EGTA, 0,2 mM ADP, 0,3 mM glucose, 0,1 mM DTT, pH 8.0) bij 20 µM concentratie van elk eiwit, gemengd in een 1:1 verhouding met 2× laadbuffer (loopbuffer met 20% glycerol, broomfenolblauw, geen ADP of MgCl2) en vervolgens 5 µl volume aangebracht op 50 µl monsterputjes. Gels werden uitgevoerd bij 100 V op ijs gedurende 4 h.

Fluorometrische actine filament demontage assay

De steady-state demontage van ADP-actine filamenten werd uitgevoerd als volgt: 5% pyreen-actine werd gepolymeriseerd in 20 mM HEPES, 100 mM NaCl, 1 mM MgCl2, 1 mM ATP, 1 mM DTT, pH 7,4 gedurende 60 min. De uiteinden van de filamenten met weerhaken werden afgedekt met 50 nM afdekeiwit. Vervolgens werd 0,5 µM cofiline (en 0,5 µM N-CAP) toegevoegd, en de reactie werd gestart door 4 µM vitamine D-bindend eiwit (monomeer-sequestratiemiddel) toe te voegen. De eindconcentratie van actine was 2,5 µM. Actine demontage werd gemeten door het volgen van pyreen fluorescentie met excitatie bij 365 nm en emissie bij 407 nm op fluorescentie spectrofotometer (Agilent) gedurende 2400 s bij 22 ° C.

CD spectrometrie

De CD spectra voor het N-CAP wildtype, mutanten en het HFD domein werden gemeten bij 20 °C met de J-720 spectropolarimeter (Jasco), in 300 µl kwarts cuvet van 0,1 cm lichtweglengte met de volgende parameters: continue scanmodus met scansnelheid van 50 nm/min, bandbreedte 0,5 nm, golfbereik 190-260 nm, data pitch 0,5 nm. Alle eiwitten werden verdund tot 15 µM met 10% PBS-buffer. Accumulatie van tien scans voor elk eiwit is uitgezet als een enkele curve.

Modellen voor atomistische MD simulaties

De cofiline-decorated actine modellen waren gebaseerd op de 3,8 Å resolutie cryo-elektronenmicroscopie structuur (PDBID: 5YU8)41. De ontbrekende lussen werden gebouwd met behulp van RosettaCM59 en RosettaScripts60 in de aanwezigheid van de elektronendichtheid kaart41 het opleggen van de bijbehorende spiraalvormige symmetrie. Om de experimentele constructen in dit werk te evenaren, werden actine en cofiline sequenties, in deze fase, veranderd van kippen naar konijnen en muizen, respectievelijk. Meer dan 1000 modellen werden gegenereerd. Deze werden vervolgens gesorteerd op basis van hun totale score en degenen die structurele artefacten bevatten (b.v. cis peptide bindingen) werden eruit gefilterd. Moleculaire dynamica (MD) simulaties werden gestart van de top scorende drie modellen (Supplementary Table 1, simulaties F1-3).

De HFD-actine complex werd geïsoleerd uit de gekristalliseerde HFD domein/actine/twinfilin ADF-H domein complex en afzonderlijk gedokt op de geselecteerde cofiline-decorated actine filament modellen hierboven beschreven. Daartoe werd de geïsoleerde HFD-actine gesuperponeerd op elk spitse actinemonomeer, dat vervolgens werd vervangen door de HFD-actine. Op deze manier is de kristalstructuur-conformatie van actine-HFD dimeer overgebracht naar de punt van de met cofiline gedockte actine. De gecoupeerde modellen werden eerst plaatselijk verfijnd met behulp van het docking protocol 61, gevolgd door een beperkte ontspanning met de snelle relax62 protocol gedistribueerd met de Rosetta Software Suite. Dit proces werd afzonderlijk toegepast voor elke cofiline-versierde actine filament geselecteerd voor MD simulaties (Supplementary Table 1, simulaties C1-3).

Constructie van het spitse einde segment voor MD simulaties

Elke simulatie werd uitgevoerd op een spitse einde segment van de geselecteerde cofiline-versierde actine filament model, dat werd gemaakt door het snijden van het model loodrecht op de as van het filament. Het vlak van de snijden werd zo gekozen dat vier hele ADP-Mg2 + gebonden actine monomeren, en drie hele cofiline monomeren werden opgenomen binnen het segment (Supplementary Tabel 1, simulaties F1-3). Het segment bevatte ook de twee HFD domeinen aan het spitse uiteinde in de HFD gebonden systemen (Supplementary Table 1, simulaties C1-3). Het spitse einde segment bevatte ook verschillende polypeptide fragmenten van cofilines en actines op zijn weerhaak einde (Supplementary Fig. 5a). Om hun conformatie en positie tijdens de simulaties te behouden, werden deze gebroken ketens gedurende de simulaties als volgt positioneel geremd gehouden: Een laag van residuen op het raakvlak met de rest van de spitse einde segment werden vrijgelaten; alle zware atomen in de buurt van het vlak van snijden en alleen ruggengraat zware-atomen voor de regio’s ertussen werden beperkt met een krachtconstante van 100 kJ/mol/nm2 (Supplementary Fig. 5a). Deze gedeeltelijk ingetoomde polypeptide fragmenten aan het uiteinde met weerhaak fungeren als een platform tijdens de simulaties. Deze aanpak handhaaft zowel de filament-achtige eiwit-eiwit interface aan het sperma einde en de oriëntatie van het filament tijdens de simulaties.

De protonatie staten van residuen werden bepaald bij de neutrale pH op basis van pKa berekeningen met PROPKA363. Elk actine H73 residu werd gemethyleerd (Nτ-Methyl-l-histidine, HIC), en de N-termini van actine, cofiline, en HFD werden geacetyleerd. De topologieën voor elk molecuul in de systemen werd voorbereid met het LeAP-programma gedistribueerd met ambertools1864, die vervolgens werden geconverteerd naar de GROMACS formaat met behulp van de ParmEd tool.

Elke puntige eind plak gemaakt van de geselecteerde modellen werd geplaatst in een zeshoekig prisma simulatie doos met de lange-as uitgelijnd met de z-as. De doos afmetingen werden gekozen om een minimale afstand van ongeveer 17 Å tussen de gloeidraad en elk gezicht van de doos (Supplementary Tabel 1) hebben. Elk systeem werd opgelost met 0,15 M NaCl oplossing met de aantallen ionen aangepast aan het systeem te neutraliseren.

Voor de productie runs, stepest descent minimalisatie en opeenvolgende korte equilibratie simulaties (in totaal ~ 7 ns) in de NVT en NpT ensembles met behulp van de Berendsen thermostaat en barostat65 werden uitgevoerd. Harmonische positiebeperkingen werden toegepast op de spitse eindschijf tijdens deze evenwichtssimulaties. Een kleinere groep atomen (alle zware atomen, de proteïne ruggengraat, en tenslotte alleen de Cα atomen) werden in elke opeenvolgende evenwichtssimulatie beperkt met een krachtconstante van 1000 kJ/mol/nm2.

De systemen die werden afgetakt van de anderen (Supplementaire Tabel 1; C1′, C2′. F2′) werden bereid door het maken van de geschikte wijziging (docking of het verwijderen van HFD domeinen), het verwijderen van de overlappende oplosmiddelmoleculen (wanneer HFD domeinen werden gedokt), en het opnieuw aanpassen van de doos grootte en oplosmiddel atomen voor de nieuwe grootte van het systeem. Gefaseerde NVT en NpT equilibratie met restricties werden uitgevoerd zoals hierboven vermeld (in totaal ~200 ps voor simulaties waar HFD domeinen werden verwijderd, en in totaal ~4 ns waar het is gedockt).

Alle productieruns werden uitgevoerd voor 1-2.5 μs in het NpT ensemble met alleen de eerder genoemde positionele restricties op het platformgebied.

Krachtvelden en parameters in MD simulaties

De volgende krachtvelden en parametersets werden gebruikt in de MD simulaties: Amber ff14sb66 voor de eiwitten, TIP3P model67 voor water, de monovalente ionen parameterset van Joung en Cheatham68 voor Na+ en Cl-, een octahedral multisite ionen model van Saxena en Sept69 voor Mg2+, en een polygefosforyleerde verbinding parameterset van Meagher et al.70 voor ADP. Ontbrekende gebonden parameters voor methyl-histidine (Nτ-Methyl-l-histidine, HIC) werden overgenomen uit het GAFF2-krachtveld64. De atomaire ladingen werden berekend volgens het protocol van Duan et al.71 R.E.D.III.5 software72 werd gebruikt voor multiconformation restrained electrostatic potential (RESP) fitting met behulp van een verlengde en een α-helische conformatie van HIC dipeptide (Ace-HIC-Nme). Alle kwantumchemische berekeningen zijn uitgevoerd met de Gaussian09 programma suite73 op het b3LYP/cc-pVTZ niveau van de theorie. Charge berekeningen werden uitgevoerd met het IEFPCM model in een polariseerbaar continuüm met een diëlektrische constante van 4 door het oplosmiddel in te stellen als ether.

MD simulatieprotocollen

Alle simulaties werden uitgevoerd met GROMACS 2018 74. De bewegingsvergelijkingen werden geïntegreerd met behulp van een leap-frog algoritme met een 2 fs tijdstap. Alle bindingen werden ingeperkt met het LINCS-algoritme75. De simulatieprotocollen werden gekozen volgens ref. 66. Lange afstand elektrostatische interacties werden behandeld door de gladde deeltjesmaas Ewald schema76 met een reële-ruimte cutoff van 0,8 nm, een Fourier spacing van 0,12 nm, en een vierde-orde interpolatie. Lennard-Jones potentiaal met een cutoff van 0.8 nm werd gebruikt voor van der Waals interacties. Lange-afstandsdispersie correcties werden toegepast voor energie en druk77.

Alle productie simulaties werden uitgevoerd in het NpT ensemble. De spitse eindschijf, het platform, en oplosmiddel (water en 0,15 M NaCl) werden gekoppeld aan afzonderlijke temperatuurbaden op 310 ° K met behulp van de Nosé-Hoover thermostaat78,79 met een tijdconstante van 1,0 ps. Isotrope druk koppeling werd uitgevoerd met behulp van de Parrinello-Rahman barostat80 met een referentiedruk van 1 atm, een tijdconstante van 5 ps, en een samendrukbaarheid van 4,5 x 10-5 bar-1.

Analyse van de MD simulaties

Alle analyses werden uitgevoerd met behulp van VMD81 en in-house scripts. De MMGBSA berekeningen werden uitgevoerd met behulp van de MMPBSA.py software82 gedistribueerd met ambertools1864 met behulp van de gewijzigde GB-model ontwikkeld door Onufriev et al.83 met 0,15 M zoutconcentratie (frames bemonsterd om de 100 ns weglaten van de eerste 500 ns van elke simulatie).

Structurele analyses

Voor de analyse van verschillende actinestructuren en hun conformatiestaten gepresenteerd in Fig. 1d, volgden we het protocol van Tanaka et al41,84. met behulp van de F-actine structuur (PDB 6djo) als de reference.

Statistische analyse en reproduceerbaarheid

Data in Figs. 2d, 4b en 4d werden gepoold van verschillende experimenten uitgevoerd op verschillende dagen, dus vertegenwoordigen gegevens van verschillende onafhankelijke experimenten. Panelen 2f, 2g, 2h en 3d presenteren gegevens geanalyseerd uit een representatief experiment. n beschrijft het aantal filamenten geanalyseerd voor panelen 2d, 2f, 2g, 4b en 4d. n in paneel 6c komt overeen met het aantal keren dat het experiment werd uitgevoerd.

Experimenten in supplementaire Figs. 2a-d, 3c, 6a-d werden uitgevoerd met vergelijkbare resultaten ten minste tweemaal. Experimenten in 3d, het CARP-domeincompetitie-experiment in 6a, en de experimenten onder assemblagebevorderende omstandigheden in Fig. 7 werden eenmaal uitgevoerd.

Rapportagesamenvatting

Meer informatie over de onderzoeksopzet is beschikbaar in de aan dit artikel gekoppelde Nature Research Reporting Summary.