In vivo RyR1 reductie in spieren triggert een core-achtige myopathie

Generatie van het RyR1Flox/Flox::HSA-Cre-ERT2 muismodel

Een muizenlijn met loxP sites ingevoegd aan beide zijden van exonen 9-11 van het RYR1 gen (zogenaamde RyR1Flox/Flox) werd gepaard met de muizenlijn HSA-Cre-ERT2 die het tamoxifen-afhankelijke Cre-ERT2 recombinase uitdrukt onder de controle van het menselijke skeletspier α-actine gen , om RyR1Flox/Flox::HSA-Cre-ERT2 te creëren. Tamoxifen injectie induceert activering van de Cre-ERT2 recombinase selectief in skeletspieren, wat resulteert in de deletie van exonen 9-11 en verstoring van het RYR1 gen in skeletspieren met een strikte tamoxifen afhankelijkheid (Fig. 1a). Bij de geboorte, RyR1Flox/Flox::HSA-Cre-ERT2 muizen waren normaal, en op 2 maanden leeftijd, eenmaal jonge volwassenen, werd de recombinatie geïnduceerd door tamoxifen injectie (vanaf dit tijdstip, de gerecombineerde dieren werden genoemd RyR1-Rec). Moleculaire en fysiologische gevolgen werden verder bestudeerd als functie van de tijd, tot 105 dagen na de inductie van recombinatie (Fig. 1b). Controle dieren (CTRL) zijn nestgenoten RyR1Flox / Flox (zonder de HSA-Cre-ERT2 transgen) geïnjecteerd met tamoxifen. Het algemene fenotype van de gerecombineerde muizen op 75 dagen wordt gekenmerkt door een kyfose die gepaard gaat met een abnormale beweeglijkheid van de achterste ledematen en waggelend lopen. De dieren zijn nog steeds in staat op hun achterpoten te staan om te eten, maar naarmate de ziekte vorderde, werden systematisch voedselbolletjes rechtstreeks in de kooi gegeven. Na 105 dagen zijn de dieren nog steeds mobiel in hun kooi en is geen verhoogd sterftecijfer waargenomen in vergelijking met CTRL. Zowel mannetjes als vrouwtjes werden aangetast. De relatieve hoeveelheid RyR1 op mRNA niveau werd geanalyseerd in de quadriceps spier om de 15 dagen na recombinatie met behulp van RT-q-PCR in CTRL en in RyR1-Rec dieren (Fig. 1c). Een snelle daling van RyR1 mRNA werd waargenomen, met een laag en stabiel niveau van 21% ± 4% van de oorspronkelijke waarde bereikt reeds 3 dagen na tamoxifen injectie. Een vermindering werd waargenomen in alle geteste spieren 75 dagen na recombinatie-inductie (Quadriceps, tibialis anterior, EDL, soleus, Additional file 1: Fig. S1A). De hoeveelheid RyR1 eiwit werd verder geanalyseerd, met behulp van kwantitatieve Western blot in quadriceps spierhomogenaten (Fig. 1d, e). Deze hoeveelheid werd progressief verminderd en bereikte ongeveer 50% van de initiële waarde na 105 dagen. Er werd geen verdere afname van RyR1-eiwit waargenomen op langere tijden (gegevens niet weergegeven). De hoeveelheid RyR1-eiwit werd gekwantificeerd in verschillende spierhomogenaten 75 dagen na recombinatie. Een vermindering werd waargenomen in alle onderzochte spieren, hoewel de resterende hoeveelheid licht verschilde tussen de spieren, waarbij de hoogste waarde werd waargenomen in de interosseus (64% ± 5%) en de laagste in de soleus (33% ± 5%) (Additional file 1: Fig. S1B).

RyR1-Rec muizen vertonen een progressieve vermindering in spier- en lichaamsgewicht en in spierkracht

De gevolgen van RyR1 vermindering werden eerst bestudeerd op het niveau van het hele dier. Aanvankelijk op hetzelfde gewicht, namen de CTRL dieren langzaam in gewicht toe van 24,4 ± 0,4 tot 30,6 ± 0,8 g op D90, terwijl de RyR1-Rec dieren progressief gewicht verloren tot 20,6 ± 1,3 g op D90 (Fig. 2a). Zowel mannetjes als vrouwtjes werden aangetast en verloren ongeveer 13% van hun oorspronkelijke lichaamsgewicht na 75 dagen (Additional file 1: Fig. S1C). Dit is het resultaat van een gewichtsverlies dat in alle spieren werd waargenomen (Additional file 1: Fig. S1D). Om de algemene spierprestatie na RyR1 reductie te testen, werden de dieren onderworpen aan twee verschillende krachttesten. Eerst mochten ze met alle vier de poten tot 5 min hangen aan een gekruist oppervlak, waarbij de latentie om te vallen de spierkracht weerspiegelde. De greeptest die wekelijks werd uitgevoerd gedurende 105 dagen (Fig. 2b) toonde aan dat RyR1-Rec dieren kracht begonnen te verliezen 20-30 dagen na tamoxifen injectie, wanneer de hoeveelheid RyR1 ongeveer 75-80% van de beginwaarde was, en niet in staat waren om aan het rooster te hangen ongeveer 75 dagen na tamoxifen injectie, als RyR1 hoeveelheid het niveau van ongeveer 60% had bereikt. Spierkracht werd ook beoordeeld door een 6 minuten durende niet-invasieve elektrostimulatie protocol van de gastrocnemius spier gekoppeld aan anatomische magnetische resonantie beeldvorming (MRI) onder algehele anesthesie. Tijdens het elektrostimulatie protocol van CTRL dieren 30 dagen na tamoxifen injectie (Fig. 2c, D30) werd een typisch inspanningsprofiel geregistreerd, met een stabiele initiële spierkracht die langzaam afnam naarmate de spier vermoeider werd. In de CTRL groep op D60 en D90 toonde het inspanningsprofiel verbeterde spierkracht naarmate de dieren ouder werden (Fig. 2c). In tegenstelling hiermee, verslechterde de prestatie van RyR1-Rec dieren, vergelijkbaar met CTRL op D30, met de leeftijd. RyR1-Rec dieren waren niet meer in staat om de oefening uit te voeren op D90 (Fig. 2c, RyR1-Rec D90). Gastrocnemius volume gemeten met behulp van MR beelden (Fig. 2d) bleef stabiel in CTRL dieren van D30 (161 ± 5 mm3) tot D90 (164 ± 4 mm3). In tegenstelling, in RyR1-Rec muizen, was het gastrocnemius volume significant kleiner dan in CTRL muizen sinds D30 (141 ± 3 mm3, p = 0,003), en was verder verminderd tot 100 ± 3 mm3 bij D60 (p < 0,001 in vergelijking met CTRL op dezelfde leeftijd) en 69 ± 4 mm3 bij D90 (p < 0,001 in vergelijking met CTRL op dezelfde leeftijd). De maximale specifieke trekspanning (absolute trekspanning genormaliseerd naar spiervolume) bevestigt dat beide groepen een vergelijkbare spierkracht vertoonden op D30 (Fig. 2e), maar dat de RyR1-Rec kracht van de dieren dramatisch afnam terwijl deze toenam bij CTRL dieren naarmate ze ouder werden. Bovendien werden de veranderingen in de gastrocnemius spier bio-energetica tijdens de elektrostimulatie niet-invasief beoordeeld op D60 met behulp van in vivo 31-fosfor (31P) MR spectroscopie. Terwijl de basale intramyofibrillaire pH niet verschilde tussen beide groepen (Additional file 1: Fig. S2A), was de mate van acidose aan het einde van de oefening lager (p = 0,016) in RyR1 Rec dieren (Additional file 1: Fig. S2B), wat suggereert dat de glycolytische flux in de spier tijdens de training was verminderd in deze dieren. Bovendien was de tijdconstante van post- inspanning fosfocreatine resynthese (τPCr) significant korter (p = 0,047) in RyR1-Rec muizen (Additional file 1: Fig. S2C, D), wat wijst op een verbeterde in vivo mitochondriale functie. Inderdaad, PCr synthese tijdens de post-exercitie herstelperiode is uitsluitend afhankelijk van oxidatieve ATP synthese, dus τPCr wordt beschouwd als een index van de oxidatieve fosforylatie capaciteit . Over het geheel genomen wijzen deze resultaten erop dat een progressieve reductie van RyR1 gepaard gaat met een progressief gewichtsverlies en een afname van de spierkracht.

De fysiologische eigenschappen van geïsoleerde vezels zijn gecompromitteerd in RyR1-Rec muizen

De verandering van de spierfunctie werd verder gekarakteriseerd op het niveau van de afzonderlijke spiervezels met behulp van een combinatie van whole-cell voltage-clamp en confocale beeldvorming. Het T-tubule netwerk werd in beeld gebracht door het plasmamembraan te kleuren met di-8-anepps. Geen kwalitatief verschil in het netwerk (Fig. 3a, links) of kwantitatief verschil in de gemiddelde T-tubule dichtheid tussen CTRL en RyR1-Rec vezels werden waargenomen, naast een lichte maar significante verkorting van de gemiddelde rust sarcomeer lengte (Fig. 3a, grafieken aan de rechterkant). De voltage-geactiveerde Ca2+ influx door de DHPR (Fig. 3b-d) en de Ca2+ afgifte flux door RyR1 (Fig. 3e-i) werden simultaan beoordeeld. In vergelijking met CTRL vezels, vertoonden RyR1-Rec vezels spanningsgeactiveerde DHPR Ca2+ stromen met een vergelijkbaar tijdsverloop (Fig. 3b) maar verminderde dichtheid, zoals blijkt uit de piek stroomdichtheid versus spanning in de twee groepen (Fig. 3c), wat zich vertaalde in een 30% reductie in maximale geleiding (Gmax) met geen geassocieerde verandering in de andere parameters van de stroom vs. spanning relatie (Fig. 3d). De spanningsafhankelijkheid van SR Ca2 + vrijgave werd beoordeeld van line-scan beeldvorming van de Ca 2 +-gevoelige kleurstof rhod-2. Line-scan beelden van de RyR1-Rec vezels waren kwalitatief vergelijkbaar met die van CTRL vezels (Fig. 3e), met een snelle stijging van de fluorescentie op T-tubule membraan depolarisatie, ruimtelijk homogeen langs de gescande lijn. De snelheid van SR Ca 2 + release (Fig. 3g), berekend uit de veranderingen in rhod-2 fluorescentie opgewekt door depolariserende pulsen van toenemende amplitude (Fig. 3f), vertoonde een vergelijkbaar tijdsverloop in RyR1-Rec vezels als in CTRL vezels, maar belangrijk, piekwaarden werden verminderd in RyR1-Rec. Passend van de pieksnelheid van SR Ca2 + release vs spanning (Fig. 3h-top grafiek) toonde aan dat de maximale snelheid van Ca2 + release werd verminderd met 25% in de RyR1-Rec groep (Fig. 3i, Max), de helling factor (k) was ook iets maar significant verminderd, terwijl de spanning van midden-activatie (V0.5) ongewijzigd was. Een lichte (gemiddeld 1.3 ms) maar significante toename in de tijd-tot-piek snelheid van SR Ca2+ afgifte in de RyR1-Rec vezels (Fig. 3h, onderste grafiek) werd waargenomen. Geen wijzigingen werden waargenomen in de cytosolische Ca 2 + verwijdering mogelijkheden van de vezels (SERCA pompfunctie), gemeten met de low-affinity Ca 2 +-gevoelige kleurstof fluo-4 FF in niet-EGTA-buffering voorwaarden (Additional file 1: Fig. S3). In het algemeen tonen deze resultaten aan dat de vermindering van 35% in RyR1 hoeveelheid in interosseus gepaard gaat met een vermindering van 30% in calciumstroom door DHPR en een vermindering van 25% in calcium flux door RyR1.

RyR1 reductie beïnvloedt de skeletspier structuur

Om beter te begrijpen de basis van deze functionele veranderingen geassocieerd met een daling van RyR1, werd spierstructuur bestudeerd op RyR1-Rec dieren op D75 na recombinatie, en vergeleken met CTRL dieren. Extensor digitorum longus (EDL), een snel trillende spier, soleus, een traag trillende spier en tibialis anterior (TA), een gemengde spier werden geanalyseerd met behulp van hematoxyline-eosine, NADH en Gomori trichrome kleuringen. Vlekken van TA, gepresenteerd in Fig. 4a, tonen een abnormale spierstructuur in RyR1-Rec dieren, zonder fibrose of centrale kernen, maar met vezelatrofie, waarbij zowel type I als type II vezels zijn aangetast (Tabel 2). Een mitochondria disorganisatie gekenmerkt door lokale accumulatie/depletie in aangrenzende regio’s van dezelfde vezel (pijlpunt en inzet Fig. 4a) en rode kleuring accumulatie waargenomen met Gomori trichroom (Additional file 1: Fig. S4) werd ook waargenomen, lijkend op de stoffige kernen die recent bij patiënten werden beschreven. Vezel atrofie werd waargenomen in beide vezel typen in EDL, hoewel de vermindering was iets belangrijker in type I vezels (tabel 2). Transversale TA sectie van CTRL en RyR1-Rec muizen werden gekleurd met antilichamen tegen RyR1 en desmin. Er werd geen verandering waargenomen in de RyR1 verdeling tussen type I en type II vezels in RyR1-Rec TA secties, wat wijst op een gelijkaardige RyR1 reductie in alle vezeltypes (Fig. 4b). Verrassend, werd een belangrijke wijziging waargenomen in desmin distributie, met een enorme toename in de kleine type I vezels (Fig. 4b): in CTRL TA secties, vertoonden alle vezels een vergelijkbare perifere kleuring, terwijl de kleine type I vezels in RyR1-Rec TA secties zwaar gekleurd waren zowel aan de vezel periferie als in het cytosol (inzet Fig. 4b). Hoewel de IF-labeling niet kwantitatief is, tonen deze resultaten aan dat de RyR1-reductie hoogstwaarschijnlijk homogeen was, zonder grote verschillen tussen aangrenzende vezels zoals waargenomen voor desmin, waarbij de kwantificering uitgevoerd door Western blot de reflectie van eiwit in elke vezel is en niet een gemiddelde van vezels met 0% RyR1 en vezels met 100% RyR1 binnen dezelfde spier.

Triaden organisatie werd verder bestudeerd met behulp van immunofluorescente etikettering van geïsoleerde EDL vezels (Fig. 5a). De labeling van alpha-actinine (als marker van de Z-lijn), van triadine en van RyR1 (als triade markers) op RyR1-Rec EDL vezels toonde aan dat de reductie in RyR1 hoeveelheid resulteerde in een algemene disorganisatie van de vezel met abnormale triaden lokalisatie en verstoring van de Z-lijn, maar triadine en RyR1 waren nog steeds gedeeltelijk gecollokaliseerd. Hoewel triaden aan beide zijden van de Z-lijn bleven, vormde de Z-lijn geen rechte lijn zoals in CTRL en vertoonde in plaats daarvan vele micro-verstoringen (inzet Fig. 5a). Spier ultrastructuur werd geanalyseerd met behulp van elektronenmicroscopie op RyR1-Rec EDL vezels bij D75 (Fig. 5b). Sommige regio’s hadden een relatief behouden structuur (Fig. 5b, linker vezel), terwijl sommige aangrenzende regio’s zeer gedesorganiseerd waren, met verstoring van de sarcomeer regelmatige organisatie, mitochondriën desorganisatie, en de aanwezigheid van talrijke stapels van membraan (Fig. 5b, pijlen, vergroot in inzet), voorheen meerdere triades genoemd. De morfologische kenmerken van deze meervoudige triades in vergelijking met de normale enkelvoudige triades worden gepresenteerd in Tabel 3, en aanvullende voorbeelden worden gepresenteerd in Additional file 1: Fig. S5. Nauwkeurige kwantificering van de vermeende T-tubulus breedte, vermeende SR breedte en intermembraan (T-tubulus/SR) ruimte (Additional file 1: Fig. S5) toonde een enorme toename aan van de gemiddelde T-tubulus grootte in deze meervoudige triades (tweevoudige toename, tot 202% van de T-tubulus grootte in normale triades), terwijl de gemiddelde SR breedte slechts licht toenam (+ 10%) en de intermembraan ruimte niet gewijzigd werd. Deze resultaten wijzen op een gegeneraliseerde structurele disorganisatie van RyR1-Rec muizen spieren geassocieerd met membraan remodellering.

RyR1 reductie is geassocieerd met wijziging in de hoeveelheid van talrijke eiwitten

De gevolgen van RyR1 reductie werden bestudeerd op moleculair niveau met behulp van kwantitatieve Western blot op quadriceps spier van CTRL of RyR1-Rec muizen (8 dieren in elke groep) op D75 na tamoxifen injectie (Fig. 6). De relatieve hoeveelheid van talrijke eiwitten die direct of indirect betrokken zijn bij calciumverwerking werd geschat, met als referentie de totale hoeveelheid eiwitten bepaald door vlekvrije evaluatie. Er werd geen verschil waargenomen in de kwantificering van RyR1 tussen deze methode en het gebruik van myosine zware keten als referentie-eiwit (vergelijking tussen Fig. 1, 6). Geen significante verandering tussen CRTL en RyR1-Rec spieren werd waargenomen in de hoeveelheid van de triadin isovorm T95, het calcium bindend eiwit CSQ1, de Ca2+-ATPase SERCA, de mitochondriale FoF1-ATPase, en de alpha 1 subeenheid van DHPR (Fig. 6a, b). Daarentegen werd een toename waargenomen in de hoeveelheid STIM1 (× 3,7 ± 1, p = 0,02), de triadine isovorm T51 (× 1,6 ± 0,1, p < 0,001), CLIMP63 (× 1,8 ± 0,2, p = 0,004), en ORAI1 (× 3,7 ± 1, p = 0,017). Aangezien wijziging in de lokalisatie van het structurele eiwit desmin werd waargenomen met behulp van immunofluorescente labeling (Fig. 5b), werd het desmin expressieniveau ook gekwantificeerd en een enorme toename in desmin hoeveelheid werd waargenomen (× 8,2 ± 1,2, p = 0,001). De lokalisatie van CLIMP63 en STIM1 in RyR1-Rec EDL vezels werd geanalyseerd met behulp van immunofluorescente labeling, en er werd geen belangrijke wijziging waargenomen (Additional file 1: Fig. S6). Daarom werd RyR1 eiwitvermindering geassocieerd met een toename van verschillende eiwitten die betrokken zijn bij calciumregulatie of in spierarchitectuur.

Autofagie is veranderd als gevolg van RyR1 reductie

Afwijking in autofagie is waargenomen in sommige myopathieën . Om de mechanismen te identificeren die leiden tot de spieratrofie als gevolg van RyR1 reductie, zochten we naar modificaties in de autofagie flux in RyR1-Rec spieren. De hoeveelheid LC3 II, een membraaneiwit van de autofagosomen, werd geëvalueerd met kwantitatieve Western blot (Fig. 7a, b), en een toename van LC3 II werd waargenomen (172% ± 32%, p = 0,03). Deze toename van autofagosomen zou kunnen wijzen op een toename van de vorming van autofagosomen (als gevolg van een toename van het autofagieproces) of op een afname van hun fusie met lysosomen (en dus op een remming van de autofagieafbraak). De precieze aard van de wijziging van de autofagie-flux werd verder geanalyseerd door kwantificering van p62, een bekend eiwit dat specifiek via autofagie wordt afgebroken, en waarvan de hoeveelheid ook significant toenam (Fig. 7a, b, 172% ± 22%, p = 0,006). De geassocieerde toename van LC3 II en van p62 in RyR1-Rec spier vergeleken met de controle suggereerde dat RyR1 reductie dus geassocieerd was met remming van de autofagie flux. Bovendien werd een toename van de activering (fosforylering) van twee remmers van autofagie, mTOR en S6-eiwit (Fig. 7b, c), waargenomen (P-mTOR/mTOR toename met 174% ± 17%, p = 0,01; P-S6/S6 toename met 320% ± 50%, p < 0,001). De toename van de fosforylering van deze twee autofagieremmers in RyR1-Rec dieren in vergelijking met controles wees verder in de richting van een remming van autofagie die verantwoordelijk is voor de spieratrofie in RyR1-Rec dieren.

Biopten van menselijke patiënten vertonen gelijkaardige afwijkingen als die waargenomen in RyR1-Rec muizen

In een recente studie bij een groot cohort van patiënten met een recessieve congenitale myopathie , hebben we de aanwezigheid van atypische structuren, “stoffige kernen” genoemd, vastgesteld bij meer dan de helft van de patiënten met een vermindering van de RyR1 hoeveelheid. Ze werden waargenomen door meervoudige kleuring en verschillen van de klassieke centrale kern (goed gedefinieerde gebieden zonder oxidatieve kleuring) door hun slecht gedefinieerde grenzen, hun focale myofibrillaire disorganisatie, een rood-paarse korrelige materiaalafzetting bij Gomori trichrome kleuring en gemengde gebieden met verminderde en/of verhoogde enzymatische activiteit bij oxidatieve kleuring (Additional file 1: Fig. S7). Deze structurele veranderingen weerspiegelen de modificaties waargenomen in ons muismodel (Fig. 4 en Additional file 1: Fig. S7). Daarom vergeleken we verder ons nieuwe muismodel en spierbiopten van patiënten met een RyR1 eiwitvermindering en “stoffige kernen”. Met behulp van kwantitatieve Western blot, werd de hoeveelheid van de eiwitten die duidelijk gemodificeerd waren in ons muismodel ook geschat in 5 patiënten met een recessieve Dusty Core ziekte (twee RyR1 mutaties resulterend in RyR1 eiwit reductie-Fig. 8a). Controle biopten van verschillende leeftijd (tussen 3,5 en 64 jaar) werden gebruikt als referentie. Een grote reductie in RyR1 eiwit werd waargenomen bij alle patiënten (gemiddeld expressieniveau 19,8% ± 2,2% van CTRL, p < 0,001). Bovendien werd ook een toename van CLIMP63 en desmin waargenomen. De vermindering van RyR1 was geassocieerd met een belangrijke toename van CLIMP63 (gemiddelde expressieniveau toename vijfvoudig, 516% ± 220%). Bovendien was het expressieniveau van desmin ook drastisch verhoogd bij patiënten in vergelijking met de controle (gemiddelde toename van het expressieniveau 240-voudig, 24 170% ± 7 635%). Met behulp van elektronenmicroscopie om de ultrastructuur van de patiëntenbiopsie te analyseren, werden vele stapels membranen waargenomen in de ongeorganiseerde regio’s (Fig. 8c, pijlen) van alle patiënten. Deze gebieden, vergelijkbaar met de stapels waargenomen in RyR1-Rec spieren (Fig. 4b), wezen op een gemeenschappelijk mechanisme, zowel in muizen als in mensen, dat leidt tot de vorming van deze structuren als gevolg van RyR1 reductie. Met identieke modificaties als die bij patiënten met de ziekte van Dusty Core, vormt dit model dus een relevant model om de pathofysiologische mechanismen te bestuderen.