Abstract
Helicobacter pylori (Hp) is verantwoordelijk voor één van de meest voorkomende infecties in de wereld. De prevalentie bedraagt meer dan 50% van de bevolking in ontwikkelingslanden, en ongeveer een derde van de volwassenen is gekoloniseerd in Noord-Europa en Noord-Amerika. Het wordt beschouwd als een belangrijke ziekteverwekker van chronische gastritis, maagzweer, atrofische gastritis, maagkanker, en mucosa-geassocieerd lymfoïd weefsel lymfoom (MALT). Kolonisatie met Hp wijzigt de samenstelling van de maagmicrobiota, wat de ontwikkeling van maagaandoeningen in de hand zou kunnen werken. Een opkomend probleem bij de behandeling van Hp is de toenemende resistentie tegen antimicrobiële therapie. In deze context kan het zoeken naar adjuvante middelen zeer nuttig zijn om dit probleem te overwinnen en de toediening van probiotica kan een geldige optie zijn. Het doel van deze review is het beschrijven van de veranderingen in de maagmicrobiota tijdens kolonisatie met Hp, de werkingsmechanismen, en een mogelijke rol van probiotica bij de behandeling van deze infectie.
1. Inleiding
Helicobacter pylori (Hp) is een Gram-negatieve, spiraalvormige, gevleugelde bacterie die behoort tot het Proteobacteria fylum met een sterk vermogen om te overleven in het agressieve zure milieu van de maag. Hp is verantwoordelijk voor een van de meest wijdverbreide infecties ter wereld, en het aantal geïnfecteerde personen is wereldwijd nog steeds zeer hoog. De prevalentie bedraagt meer dan 50% van de bevolking in sommige delen van de wereld, zoals Zuid- en Oost-Europa, Zuid-Amerika en Azië. Lage sociaal-economische status, slecht onderwijsniveau en slechte hygiënische omstandigheden zijn de belangrijkste risicofactoren. Met name in Noord-Europa en Noord-Amerika is ongeveer een derde van de volwassenen gekoloniseerd.
Scheidene recente bewijzen hebben aangetoond dat Hp de samenstelling van de maagmicrobiota kan wijzigen en dat de resulterende veranderingen een rol kunnen spelen bij de ontwikkeling van Hp-gerelateerde ziekten. Toch moet de interactie tussen de gastheer, microbiota, en Hp in de pathogenese van deze aandoeningen volledig worden opgehelderd.
Hp kolonisatie kan chronische gastritis, een maagzweer, atrofische gastritis, maagadenocarcinoom, en mucosa-geassocieerd lymfoïde weefsel lymfoom (MALT) veroorzaken. Hp gastritis wordt beschouwd als een infectieziekte ongeacht de symptomen en het ziektestadium, en eradicatietherapie wordt sterk aanbevolen . Een snelle opkomst van antibiotica-resistente bacteriën wordt echter een van ’s werelds meest kritieke volksgezondheidsproblemen, en dus wordt de keuze van therapeutische opties voor de behandeling van Hp-infectie geconfronteerd met dit dilemma .
In deze context kan het gebruik van probiotica, gedefinieerd als “levende micro-organismen die wanneer toegediend in voldoende hoeveelheden een gezondheidsvoordeel voor de gastheer opleveren” nuttig zijn voor hun antibacteriële activiteit tegen Hp en voor de interactie met het complexe ecosysteem van de gastheer .
De gunstige eigenschappen van probiotica op de microbiologische omgeving van de gastheer kunnen in verband worden gebracht met hun potentiële effecten op de spijsverteringsmicroflora en het darmimmuunsysteem, waaronder hun vermogen om te concurreren met darmpathogenen, de IgA-secretie te verhogen, de mRNA-expressie en secretie van cytokinen te moduleren, de mucine-, bacteriocine- en melkzuurproductie te stimuleren, en de groei van de microbiota te moduleren .
Het doel van deze review is een overzicht te geven van de veranderingen in de samenstelling van de maagmicrobiota tijdens Hp-infectie, en vervolgens de potentiële rol van probiotica bij Hp-geïnduceerde dysbiose en eradicatie te beoordelen. Er werd een kritische beoordeling gemaakt van het klinische onderzoeksbewijs over de gegevens betreffende Hp en de samenstelling van de maagmicrobiota en over de effectiviteit van probiotica bij de behandeling van Hp-infectie en ter voorkoming van bijwerkingen van antimicrobiële therapie. De zoekactie werd beperkt tot volledige Engelstalige manuscripten.
2. Helicobacter pylori and Gastric Microbiota Composition
De maag is altijd beschouwd als een steriel orgaan. Het is niet verwonderlijk dat lange tijd werd aangenomen dat de lage pH van het maaglumen en de peristaltiek bijdroegen tot het creëren van een ongunstige omgeving voor bacteriële overleving en stabiele microbiële kolonisatie van dit orgaan. In 1983 echter gaf de ontdekking van Hp door Marshall en Warren de aanzet tot een periode van progressieve ontdekkingen op het gebied van maagontsteking en zorgde voor een doorbraak in het begrijpen van het micro-ecologisch milieu in de maag. De verbetering van de microbiële opsporingstechnieken is van cruciaal belang geweest. De aanvankelijke analyse werd uitgevoerd met behulp van op kweek gebaseerde methoden, die verschillende beperkingen in zich dragen; zij hebben met name betrekking op een groot aantal bacteriën die nog steeds als “niet kweekbaar” worden beschouwd als gevolg van groeiresistentie in conventionele kweekmedia, behoefte aan bijzondere omgevingsomstandigheden, lage bacteriële groeisnelheid, en interactie met andere bacteriën of hun afgescheiden substraten . Tezamen of afzonderlijk kunnen deze factoren een onvolledige en beperkte representatie van de complexe gastrische bacteriegemeenschap bepalen, die ten onrechte een vergelijkbare samenstelling van de maagmicrobiota bij Hp-patiënten laat zien in vergelijking met gezonde personen. De meest recente moleculaire technieken die een diepgaande studie van de maagmicrobiota mogelijk maken, hebben daarentegen een significant verschil in samenstelling van de microbiota tussen Hp-positieve en gezonde personen aan het licht gebracht. De techniek bestaat uit het sequencen van het ribosomale gen 16S rRNA dat 9 variabele regio’s bevat die in alle bacteriën aanwezig zijn en die vergelijkbaar zijn bij de micro-organismen van dezelfde fyla. Technisch gezien maakt dit type analyse het mogelijk verschillende bacteriesoorten te herkennen door analyse van het genoma, wat het moeilijk maakt de vitaliteit van micro-organismen te beoordelen. Om dit nadeel te vermijden, verdient het de voorkeur gebruik te maken van bacterieel RNA in plaats van DNA.
Huidig weten wij dat, bij gezonde proefpersonen, de maagmicrobiota op fylair niveau hoofdzakelijk bestaat uit Firmicutes, Bacteroidetes, Proteobacteria, en Actinobacteria. De meest aanwezige geslachten zijn Streptococcus, gevolgd door Veillonella, Prevotella, Fusobacterium, en Rothia . Analyse van maagsap en biopten heeft uitgewezen dat de dichtheid van de maagmicrobiota lager is dan in andere delen van het maagdarmkanaal (GI) en ongeveer 101-103 CFU/ml bedraagt. De aanwezigheid van bacteriën in de maag is mogelijk door de progressieve verschuiving van de pH van het maaglumen (pH 1-2) naar het slijmvliesoppervlak (pH 6-7), dat bedekt is met slijm dat actief wordt afgescheiden door de maagklieren. Deze pH-gradiënt maakt de ontwikkeling mogelijk van verschillende milieus die de groei van micro-organismen mogelijk maken, waarbij het slijmvliesoppervlak het meest gastvrije maaggebied is. Hp kolonisatie van maagslijmvlies verandert deze gastrische habitat door deconstructie van de slijmlaag en door alkalinisatie van maagsap.
In Hp-positieve personen, toonde moleculaire analyse een algehele afname in bacteriële diversiteit met de absolute prevalentie op fyla niveau van Proteobacteria, gevolgd door Firmicutes, Bacteroidetes, en Actinobacteria. In de subanalyse van de geslachten, met uitzondering van Hp die de meest vertegenwoordigde soort blijkt te zijn, zijn Streptokokken meestal de tweede gedetecteerde bacterie. Een interessante studie van Andersson e.a., waarbij monsters van zowel Hp-positieve als gezonde personen werden geëvalueerd, toonde aan dat de aanwezigheid van Hp een vermindering van de microbiële diversiteit veroorzaakt. Slechts 33 fylotypen werden gevonden bij Hp proefpersonen vergeleken met een rijk en gediversifieerd assortiment van maag micro-organisme van ongeveer 262 fylotypen bij gezonde mensen, hetgeen dit verschil onderstreept.
Om vast te stellen of de veranderingen in de maagmicrobiota die samen met Hp infectie werden gevonden, werden geïnduceerd door hypochlorhydrie, analyseerden Parsons et al. de samenstelling van de maagmicrobiota in verschillende hypochlorhydrische condities en bij gezonde proefpersonen. Zoals eerder beschreven, bevatte ook in deze studie de maag van gezonde proefpersonen de grootste bacteriële diversiteit in vergelijking met andere groepen. Interessant is dat de PPI-groep een microbiota karakterisering vertoont die vergelijkbaar is in een gezonde maag, ondanks de hypochlorhydrische status als gevolg van het medicijngebruik. Een significant verschil in microbiele diversiteit werd gevonden bij vergelijking van gezonde proefpersonen met Hp-gerelateerde aandoeningen en een interessant gegeven komt naar voren uit de vergelijking tussen Hp gastritis en Hp-gerelateerde atrofische gastritis. In feite werden geen significante verschillen gevonden tussen deze twee condities, wat suggereert dat, in de Hp subgroep patiënten, de rol van bacteriën superieur kan zijn in het induceren van veranderingen in de samenstelling van de maagmicrobiota vergeleken met hypochlorhydria .
De veranderingen in de maagmicrobiota als gevolg van Hp infectie kunnen worden gerelateerd aan intrinsieke eigenschappen van bacteriën. In feite is Hp voorzien van oxidase, catalase, en urease activiteiten. Het urease is een metallo-enzym dat in staat is ureum om te zetten in ammoniak en bicarbonaat en dat verantwoordelijk is voor de lokale verhoging van de pH in de maag en de veilige passage in het maaglumen. Hp flagella stellen de ziekteverwekker in staat door de slijmlaag te passeren die wordt aangedreven door de pH gradiënt, waardoor een invasie van het maagslijmvlies mogelijk wordt. Eenmaal gevestigd, stelt Hp adhesines (HopQ, HopP, en HopS) beschikbaar die een receptorspecifieke hechting aan gastrische epitheelcellen mogelijk maken en bijgevolg de expressie van CagA en VacA virulentiefactoren die de cytotoxische activiteit mediëren. Beschadiging van het slijmvlies trekt polymorfonucleaire en andere immuuncellen aan die waarschijnlijk bijdragen tot de beschadiging van de maag door de productie van cytokinen en andere ontstekingsbevorderende stoffen. Waarschijnlijk bemoeilijken deze factoren, die een vijandige omgeving creëren, de overleving van andere bacteriën, waardoor maagdysbiose kan ontstaan.
3. Helicobacter pylori uitroeiing en toediening van probiotica
Volgens het Maastricht V Consensus Report, wordt de standaard drievoudige therapie, protonpompremmer (PPI) + amoxicilline (AMX) + claritromycine (CLR), beschouwd als de eerstelijns empirische behandeling in gebieden met een lage resistentie tegen CLR. Wanneer de regionale resistentie tegen CLR hoog is, waarbij 15% van de bevolking als het randgebied wordt beschouwd, wordt een niet-bismut viervoudige therapie met PPI + AMC + metronidazol (MTZ) + CLR aanbevolen. In al deze gevallen kan een bismutviervoudige therapie als alternatief worden gebruikt en deze wordt aanbevolen als eerstelijnsbehandeling in gebieden met een hoge tweeledige CLR-MTZ-resistentie. Het voordeel van eradicatie van Hp is aangetoond bij aandoeningen zoals peptische ulcera, MALT-lymfoom, ijzergebreksanemie, idiopathische trombocytopenische purpura en vitamine B12-deficiëntie. Antibioticaresistentie leidt tot toenemende schattingen van mislukte behandelingen, zoals blijkt uit het stijgende percentage CLR-resistente stammen dat in sommige gebieden van de wereld 40-50% heeft bereikt .
Baseerd op de literatuurgegevens (tabel 1), blijkt dat sommige probiotica geassocieerd met antibiotische therapie de Hp eradicatie kunnen verbeteren en bovendien de schadelijke bijwerkingen als gevolg van antimicrobiële therapie kunnen verminderen, zoals misselijkheid, braken, diarree, buikpijn, opgeblazen gevoel, en smaakstoornissen die soms verantwoordelijk zijn voor het staken van de behandeling .
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|
O: omeprazol; P: pantoprazol; E: esomeprazol; C: claritromycine; A: amoxicilline; L: levofloxacine; T: tinidazol.
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
De rol van toediening van Lactobacillus-stammen bij de behandeling van Hp-infectie en bij het voorkomen van bijwerkingen van antimicrobiële therapie is goed gedocumenteerd. Suppletie van deze probiotica kan de groei van Hp en de kolonisatie van Hp direct verminderen. In een prospectieve, gerandomiseerde, gecontroleerde studie van Ojetti e.a. bleek dat toevoeging van een probioticum (L. reuteri 1 × 108 CFU tid gedurende 14 dagen) aan levofloxacine-gebaseerde tweedelijnstherapie een extra eradicatiepercentage van 20% opleverde in vergelijking met behandeling met alleen antibiotica, gevolgd door een consistente vermindering van symptomen zoals diarree en misselijkheid . Armuzzi et al. namen 120 asymptomatische Hp-positieve personen aan die willekeurig werden ingedeeld in twee behandelingsgroepen: de ene kreeg een drievoudige anti-Hp-therapie (PPI 40 mg bid, CLR 500 mg bid, en tinidazol 500 mg bid) en de andere kreeg dezelfde antibioticatherapie in combinatie met een Lactobacillus GG-bevattend probioticum (6 × 109 levensvatbare bacteriën) bid gedurende 14 dagen. De analyse toonde een verbetering aan van de gastro-intestinale symptomen in de probioticagroep, met een significante vermindering van smaakstoornissen (), een opgeblazen gevoel (), en diarree (). Anderzijds werden geen significante verschillen in uitroeiingspercentages gerapporteerd (groep 1 vs. groep 2; PP: 80,7% vs. 80%, ) . Uitstekende resultaten kunnen ook worden verkregen door het verstrekken van drinkbare voedingssupplementen met Lactobacillen of het cultuursupernatans daarvan.
De gunstige effecten van toediening van Bifidobacterium werden geanalyseerd door Chitapanarux et al. in een dubbelblind, placebogecontroleerd onderzoek waarbij B. longum werd gebruikt als aanvulling op de standaard drievoudige therapie. De resultaten toonden een significant gunstig effect op de eradicatiegraad van Hp (PP: 28/30, 93,33% vs. PP: 22/30, 73,33%, ) en op de vermindering van de diarreafrequentie (25% vs. 3,23%, ) zonder significante uitkomsten op misselijkheid (18,75 vs. 12,90%), smaakstoornissen (15,63% vs. 12,90%), en epigastrische pijn (6,25 vs. 3,23%) . Echter, in een eerdere studie van Yaşar et al. die 76 histopathologisch bewezen Hp-positieve patiënten includeerde, resulteerde de toevoeging van Bifidobacterium DN-173-bevattende yoghurt aan de standaard drievoudige therapie gedurende 14 dagen in een eradicatiegraad van 66% vergeleken met 53% met alleen antibiotische therapie. Hoe dan ook, de toename van Hp eradicatie was niet statistisch significant. Saccharomyces boulardii, een probioticum, was bijzonder effectief in het verminderen van de bijwerkingen van de eradicatietherapie. Song e.a. meldden dat toevoeging van dit probioticum aan een drievoudige behandeling op basis van CLR en AMX gedurende 4 weken een eradicatiepercentage van 85,4% opleverde, vergeleken met 80% bij afwezigheid van het probioticum. Gastro-intestinale bijwerkingen, met name diarree, kwamen in de laatste groep vaker voor () . Een meta-analyse door Szajewska et al. met elf RCT’s (2200 deelnemers, waaronder 330 kinderen) toonde aan dat S. boulardii het eradicatiepercentage van Hp significant verhoogde, maar onder het beoogde niveau. Dit probioticum verminderde echter significant de bijwerkingen, met name diarree en misselijkheid.
Op basis van de eigenschappen van probiotica is het aannemelijk dat een mengsel van stammen de eradicatie van Hp kan verbeteren. In een proef van Du e.a. werd een meerstammig probioticum met Lactobacillus acidophilus, Streptococcus faecalis, en Bacillus subtilis toegediend aan de patiënten gedurende twee weken vóór de antibioticumkuur of in een andere groep gedurende twee weken na de eradicatietherapie. Beide schema’s waren effectiever in het uitroeien van de Hp-infectie dan de drievoudige therapie alleen (81,6% en 82,4% vs. 61,5%), maar er was geen statistische significantie wat betreft het optreden van bijwerkingen. Een meta-analyse door Wang et al., die tien trials (1469 proefpersonen) omvatte, toonde aan dat toevoeging van probiotica met verbindingen die Lactobacillus- en Bifidobacterium-stammen bevatten, zowel het eradicatiepercentage van Hp aanzienlijk verbetert als de incidentie van bijwerkingen van antimicrobiële therapie vermindert. Bovendien werd het voordeel van probioticasuppletie aangetoond onafhankelijk van het type eradicatietherapie dat in de proef werd gebruikt, ondanks de bismut-bevattende therapie die een potentiële mislukking zou kunnen betekenen vanwege de remmende activiteit van bismut tegen de probiotica. Verder bevestigde een daaropvolgende meta-analyse door Mcfarland e.a. dat meergranen-probiotica nuttig kunnen zijn als aanvullende therapie bij de uitroeiing van Hp en bij het voorkomen van bijwerkingen van de uitroeiing, maar zij concludeerden dat niet alle mengsels even effectief waren. Lau et al. bevestigden het nut van Lactobacillus, Bifidobacterium, Saccharomyces, en probioticamengsels bij de behandeling van Hp-infectie bij zowel volwassenen als kinderen, in Aziatische en niet-Aziatische populatie.
Het gebruik van probiotica bij kinderen voor de behandeling van Hp-infectie is momenteel niet duidelijk. In de eerder genoemde meta-analyse van Wang e.a., toonde de subgroepanalyse voor kinderen geen probiotica werkzaamheid op eradicatiepercentages en vermindering van ongewenste bijwerkingen. Pacifico et al. wezen op de omstreden werkzaamheid van probiotica bij deze patiënten. Zeven trials met heterogene antibiotica- en probioticatherapieën toonden een algemeen voordeel van probioticasuppletie, maar slechts in twee daarvan waren de resultaten statistisch significant, zodat de conclusie luidde dat er geen overtuigend bewijs was voor het gebruik van probiotica in combinatie met een drievoudige therapie bij kinderen. Bovendien verklaarde de Latijns-Amerikaanse deskundigengroep in 2015 bij consensus dat er op dat moment onvoldoende bewijs was om de toediening van probiotica op dit gebied aan te bevelen . Ander bewijs suggereert echter dat sommige probiotica, zoals S. boulardii of L. casei alleen of multistammen (L. acidophilus + B. bifidum, B. mesentericus + C. butyricum + S. faecalis) kunnen nuttig zijn om Hp te behandelen en bijwerkingen als gevolg van de eradicatietherapie bij pediatrische patiënten te voorkomen, waardoor het gebruik ervan wordt aanbevolen.
De gunstige effecten van deze probiotica tegen Hp-infectie kunnen verband houden met hun intrinsieke eigenschappen die kunnen afhangen van de probiotische soort (figuur 1). Van Lactobacillen is aangetoond dat zij de volgende eigenschappen bezitten:(1)Productie van antimicrobiële stoffen, als bacteriocines die worden gesynthetiseerd door ribosomen en uitgescheiden door verschillende bacteriën, waaronder Lactobacillen. Deze stoffen zijn voorzien van antimicrobiële activiteit en vormen een belangrijk en succesvol wapen tegen andere microbiële soorten zoals Hp . Sommige bacteriocines, zoals nisine, pediocine, acidocine en lacticine, dragen bij tot de homeostase van het complexe ecosysteem van het maag-darmkanaal.(2)Het vermogen om te overleven in de zure omgeving van de maag door de productie van melkzuur en vluchtige zuren te induceren, hetgeen een remmend effect heeft op de groei van Hp. De effecten van suppletie met L. salivarius zijn gedocumenteerd in een muismodelstudie, en de werkzaamheid werd in verband gebracht met de grote hoeveelheid melkzuur die door de bacterie wordt geproduceerd en die interfereert met de urease-activiteit van de ziekteverwekker. Bovendien is L. salivarius in staat om in vitro maagontsteking te verminderen door lokale cytokine secretie te moduleren, in het bijzonder van IL-8 direct gerelateerd aan neutrofielen rekrutering en mucosale ontsteking, waarschijnlijk als een reactie op de onderdrukte secretie van CagA virulentie factor.(3)Vermogen om zich te hechten aan maag en twaalfvingerige darm cellen en zo een concurrerende actie uit te voeren tegen pathogenen. Mukai et al. ontdekten dat twee L. reuteri-stammen, JCM 1081 en TM105, in staat waren specifieke membraanglycolipiden te binden en daardoor de potentiële plaats van Hp-adhesie in te nemen, waardoor deze ziekteverwekker maagkolonisatie werd geremd.
Gelijkaardige werkingsmechanismen zijn ook beschreven voor andere probiotica. Bifidobacterium-stammen zijn in staat antimicrobiële stoffen te produceren die de groei van Hp kunnen remmen, waardoor de uitroeiing beter verloopt. Interessant genoeg suggereerde een studie van Yu e.a. bij muizen dat een probiotisch mengsel met B. longum, L. acidophilus en E. faecalis Hp-gastritis kan verlichten door de ontstekingsreactie te verminderen door de secretie van cytokinen als IL-8, TNF-α, G-CSF en GM-CSF te remmen. Omgekeerd kan S. boulardii de aanhechting van Hp aan maag- en duodenale cellen verminderen door zijn neuraminidase activiteit die in staat is om selectief de expressie van α (2-3)-gekoppeld siaalzuur op het celoppervlak te verminderen, een doelwit van Hp-aanhechtingen. Conclusie
Onze review laat zien hoe sommige probioticastammen de uitroeiing van Hp kunnen verbeteren en bijwerkingen van antimicrobiële therapie kunnen voorkomen, waarschijnlijk door het vermogen van deze micro-organismen om direct in te grijpen tegen Hp, waardoor een gezonde microbiota wordt hersteld. In Italië bedragen de gemiddelde kosten van probiotica naast antimicrobiële therapie, op basis van de studies in dit overzicht, ongeveer 2 euro per dag behandeling per patiënt. Naar onze mening zijn deze kosten ruimschoots gerechtvaardigd door de vermindering van bijwerkingen als gevolg van antibiotische therapie en het hogere eradicatiepercentage, waardoor er minder behoefte is aan een tweedelijnsbehandeling. Daarom kan de toediening van probiotica worden beschouwd als een aanvullende behandeling, vooral wanneer eradicatie van Hp niet lukt. Niet alle probiotica zijn echter even bruikbaar, en waarschijnlijk is de genezende werking afhankelijk van de stam. Aanvullende studies zijn nodig om de rol van probiotica bij Hp-infecties beter te begrijpen, vooral wanneer de geactualiseerde eradicatieschema’s worden gebruikt.
Er zijn momenteel weinig studies of meta-analyses beschikbaar over een directe vergelijking tussen gunstige effecten van verschillende probioticasoorten tijdens antimicrobiële therapie. Op grond van de beschikbare gegevens en de uitspraak van het Maastricht V Consensus Report “Bepaalde probiotica kunnen een gunstig effect hebben op de uitroeiing van Hp” bevelen wij echter het gebruik aan van Lactobacillus-, Bifidobacterium- en Saccharomyces-stammen. Niettemin zouden naar onze mening meer proeven met probiotica moeten worden toegesneden op de samenstelling van de maagmicrobiota voor en na de Hp-uitroeiingstherapie, omdat dit de rol van verschillende bacteriën bij de ontwikkeling van maagziekten zou kunnen verklaren.
Conflicts of Interest
De auteurs verklaren dat zij geen belangenconflicten hebben.
Authors’ Contributions
Giovanni Bruno en Giulia Rocco stelden het manuscript op met inbreng van alle auteurs. Piera Zaccari heeft het manuscript kritisch herzien. Barbara Porowska, Maria Teresa Mascellino, en Carola Severi zorgden voor wetenschappelijke begeleiding.