Fluorescerende Antilichaam Technieken

Door Benedette Cuffari, M.Sc.Reviewed by Emily Henderson, B.Sc.

Sinds de oorspronkelijke ontdekking in 1942 is immunofluorescentiekleuring een zeer betrouwbare en krachtige techniek gebleven voor een breed scala van onderzoeks- en diagnostische doeleinden.

Leukemiecellen gelabeld met fluorescerende moleculen. Image Credit: Vshivkova/.com

In het algemeen omvatten fluorescentie-antilichaam (FA)-technieken het gebruik van cellen of een antilichaam, waarvan de constante regio is gemerkt met een fluorescerend label, ook bekend als een fluorofoor. FA-technieken worden vaak gecategoriseerd als direct of indirect.

Direct fluorescentie antilichaam

Bij de directe fluorescentie antilichaamtechniek, die ook directe immunofluorescentie (DIF) kan worden genoemd, wordt gebruik gemaakt van een enkelvoudig fluorescent gelabeld primair antilichaam dat wordt gebruikt om zich te binden aan een doelantigeen. Bij klinisch gebruik is DIF bijzonder nuttig voor de snelle diagnose van bacteriële ziekten zoals Streptococcus pyogenes, beter bekend als streptokokken, alsmede longontsteking die het gevolg is van Mycoplasma pneumoniae en Legionella pneumophilia.

Voor dergelijke diagnostische doeleinden wordt het patiëntenmonster eerst op een microscoopglaasje geplaatst en vervolgens blootgesteld aan het fluorescerende antilichaam. Elke binding tussen het fluorescerende-gemerkte antilichaam en het doelantigeen, dat voor deze situaties bacteriën zouden zijn, zal deze stoffen doen oplichten bij onderzoek met een fluorescentiemicroscoop.

Naast het gebruik als diagnostisch hulpmiddel, wordt DIF ook veel gebruikt voor wetenschappelijk onderzoek. Voor dergelijke doeleinden wordt een bevroren weefselmonster dat in dunne secties van 5 of 6 micrometer (µm) is gesneden, op een glasplaatje geplaatst.

De plaatjes worden vervolgens geïncubeerd met een fluorescent gemerkt antilichaam, dat doorgaans een panel antilichamen zal omvatten dat is gericht tegen IgA-, IgG- en IgM-antilichaamisotypen, samen met complement 3, dat is gericht tegen het antigeen van interesse.

Merk op dat de concentratie van het antilichaam dat voor dit soort onderzoek wordt gebruikt, zal worden gebaseerd op eerdere experimenten die hebben bevestigd welke concentratie de hoogste signaal-achtergrondverhouding kan bereiken.

Nadat de objectglaasjes gedurende ten minste 30 minuten in het donker en bij kamertemperatuur zijn geïncubeerd, worden ze gewassen en vervolgens belicht met een fluorescentiemicroscoop.

Image Credit: anyaivanova/.com

Indirect fluorescentieantilichaam

In vergelijking met de eenstapstechniek die voor DIF wordt gebruikt, is indirect IF (IIF) of indirect FA (IFA) een tweestapsproces dat begint met het aanbrengen van een ongelabeld primair antilichaam op het monster dat tegen een doelantigeen is gericht. De tweede stap van IIF omvat het gebruik van een fluorescent gelabeld secundair antilichaam dat gericht is tegen het Fc-gedeelte van het primaire antilichaam.

Hoewel IIF als ingewikkelder wordt beschouwd dan DIF, omdat het langer duurt om het uit te voeren en het gebruik van twee compatibele antilichamen vereist, is het superieur in termen van zijn gevoeligheidscapaciteiten.

Een aantal veel voorkomende klinische toepassingen van IFA-tests zijn die welke worden gebruikt voor de diagnose van syfilis. Voor dit type IFA-test worden T. palladium-cellen geïsoleerd die eerder uit een onderzoeksdier zijn geïsoleerd en op het oppervlak van een glasplaatje geplaatst. Een serum van een patiënt wordt vervolgens over de T. palladium cellen verspreid, zodat anti-treponemale antilichamen, indien aanwezig, zich aan de gefixeerde antigenen kunnen binden.

Nadat het serum van de patiënt is weggespoeld, wordt een secundair antilichaam toegevoegd dat is voorzien van een fluorofore markering. Een positief syfilisresultaat zal alle secundaire antilichaam-fluorofoorconjugaatcomplexen doen oplichten.

Een ander type IFA dat veel in klinische settings wordt gebruikt, is dat voor de diagnose van systemische lupus erythematosus (SLE). Patiënten met SLE, een auto-immuunziekte, hebben een verhoogd niveau van circulerende anti-nucleaire auto-antilichamen (ANA) die gericht zijn tegen zowel DNA als verschillende eiwitten die zich aan DNA binden.

Voor dit type IFA-test worden cellen gekweekt en vervolgens op een glasplaatje geplaatst. Elk glaasje wordt vervolgens geïncubeerd met een verschillende concentratie van het antilichaam van de patiënt, dat vervolgens wordt gewassen om ongebonden eiwitten te verwijderen.

Na de wasstap wordt een fluorescerend gelabeld secundair antilichaam, dat voor de ANA-test antihumaan IgG zal zijn, aan de glaasjes toegevoegd en laat men het incuberen. Een titer van het ANA in het serum wordt dan verkregen uit de hoogste serumverdunning die fluorescentie vertoonde en wordt gebruikt om een SLE-diagnose te stellen.

Flow cytometry

Het derde type fluorescente antilichaamtechniek omvat flow cytometrie, een geautomatiseerd celtellingssysteem dat kan worden gebruikt om specifieke cellen te kwantificeren die aanwezig zijn in complexe mengsels zoals bloed of serum.

Een typisch flowcytometrie-experiment begint met de incubatie van een fluorescent gelabeld antilichaam dat gericht is tegen een specifieke subpopulatie van cellen, zoals anti-CD4, dat zich kan binden aan het glycoproteïne CD4 dat op het oppervlak van verschillende immuuncellen wordt aangetroffen, waaronder T-helpercellen, monocyten en macrofagen. Flowcytometrie kan ook de aanwezigheid van meerdere celtypen kwantificeren door gebruik te maken van geschikte celmakers.

Nadat de incubatie is voltooid, wordt het monster in de flowcytometer gebracht. In deze machine dwingt een smal capillair de cellen die in het monster aanwezig zijn, er in één enkele rij doorheen te bewegen. Terwijl de cellen door het capillair bewegen, wordt een laser gebruikt om alle cellen die met de fluorofoor zijn gemerkt, te activeren en te exciteren.

De intensiteit van de fluorescentie van elke geëxciteerde cel wordt dan gemeten door zowel voorwaartse als zijwaartse verstrooiingsdetectoren en afgebeeld op een histogram voor analyse. Naast kwantificeringsdoeleinden kunnen zowel flowcytometrie als immunofluorescentie worden gebruikt om cellen te sorteren in gezuiverde subpopulaties voor onderzoeksdoeleinden via een techniek die bekend staat als fluorescentie-geactiveerde celsorter (FACS).

• Odell, I. D., & Cook, D. (2013). Immunofluorescentietechnieken. Journal of Investigative Dermatology 133. doi:10.1038/jid.2012.455.
• Parker, N., Schneegurt, M., Tu, A. T., et al. (2016). Hoofdstuk 20.5 Fluorescente antilichaamtechnieken. In: Microbiologie. Geraadpleegd van https://openstax.org/books/microbiology/pages/20-5-fluorescent-antibody-techniques.
• Betterle, C., & Zanchetta, R. (2012). De immunofluorescentietechnieken in de diagnose van endocriene auto-immuunziekten. Autoimmunity Highlights 3(2); 67-78. doi:10.1007/s13317-012-0034-3.

Verder Lezen

• Alle Antilichamen Inhoud
• VHH Antilichamen (Nanobodies) Voordelen en Beperkingen
• Antilichaam Selectie met behulp van DNA Origami Scaffolds
• Toepassingen van Histon Deacetylase (HDAC) Antilichamen in Research
• Using Antibodies for Parkinson’s Disease Research

Written door

Benedette Cuffari

Na het voltooien van haar Bachelor of Science in Toxicologie met twee minors in Spaans en Scheikunde in 2016, Benedette vervolgde haar studie om haar Master of Science in Toxicology in mei van 2018 af te ronden. Tijdens haar graduate school onderzocht Benedette de dermatotoxiciteit van mechlorethamine en bendamustine; twee stikstofmosterd alkylerende agentia die worden gebruikt in antikankertherapie.

Last bijgewerkt 18 mrt 2021

Citaties

Gebruik een van de volgende formaten om dit artikel in uw essay, paper of verslag te citeren:

• APA

  Cuffari, Benedette. (2021, 18 maart). Fluorescerende Antilichaam Technieken. Nieuws-Medisch. Op 25 maart 2021 ontleend aan https://www.news-medical.net/life-sciences/Fluorescent-Antibody-Techniques.aspx.

• MLA

  Cuffari, Benedette. “Fluorescerende Antilichaam Technieken”. Nieuws-Medisch. 25 maart 2021. <https://www.news-medical.net/life-sciences/Fluorescent-Antibody-Techniques.aspx>.

• Chicago

  Cuffari, Benedette. “Fluorescerende antilichaam technieken”. Nieuws-Medisch. https://www.news-medical.net/life-sciences/Fluorescent-Antibody-Techniques.aspx. (accessed March 25, 2021).

• Harvard

  Cuffari, Benedette. 2021. Fluorescerende Antilichaam Technieken. Nieuws-Medisch, bekeken 25 maart 2021, https://www.news-medical.net/life-sciences/Fluorescent-Antibody-Techniques.aspx.