Doelstellingen:

1. Om onderscheid te maken tussen de twee belangrijkste categorieën van bacteriën: Gram-positieve en Gram-negatieve.
2. Om te begrijpen hoe de Gram-kleuringreactie Gram-positieve en Gram-negatieve bacteriën beïnvloedt op basis van de biochemische en structurele verschillen van hun celwanden.

Klik om de Animatie te bekijken

Vlekken is een hulptechniek die bij microscopische technieken wordt gebruikt om de helderheid van het microscopische beeld te vergroten.Vlekken en kleurstoffen worden in de wetenschap op grote schaal gebruikt om de structuur van de biologische specimens, cellen, weefsels enz.te benadrukken.

De meest gebruikte kleuringsprocedure in de microbiologie is de Gram-kleuring, ontdekt door de Deense wetenschapper en arts Hans Christian Joachim Gram in 1884. Gram-kleuring is een differentiële kleuringstechniek die bacteriën in twee groepen onderscheidt: grampositieven en gramnegatieven. De procedure is gebaseerd op het vermogen van micro-organismen om de kleur van de bij de Gram-kleuring gebruikte kleurstoffen vast te houden. Gram-negatieve bacteriën worden door de alcohol ontkleurd en verliezen de kleur van de primaire kleurstof, paars. Gram-positieve bacteriën worden niet door alcohol ontkleurd en blijven paars. Na de ontkleuringsstap wordt een tegenkleuring gebruikt om de ontkleurde Gram-negatieve organismen een roze kleur te geven.

Fig: Hans Christian Joachim Gram

Belang van een Gram-beits:

De Gram-beits is een zeer belangrijke voorbereidende stap bij de eerste karakterisering en classificatie van bacteriën. Het is ook een belangrijke procedure bij de identificatie van bacteriën op basis van kleuringseigenschappen, waardoor de bacteriën met een lichtmicroscoop kunnen worden onderzocht. De bacteriën in een niet-gekleurde uitstrijk zijn onzichtbaar wanneer zij met een lichtmicroscoop worden bekeken. Eenmaal gekleurd kunnen ook de morfologie en de rangschikking van de bacteriën worden waargenomen. Bovendien is het ook een belangrijke stap in de opsporing van infectieuze agentia in klinische specimens, zoals directe uitstrijkjes van een patiënt.

De Gram-kleuring procedure maakt het mogelijk bacteriën kleur van de vlekken te laten behouden, op basis van de verschillen in de chemische en fysische eigenschappen van de celwand.

1. Gram-positieve bacteriën: Vlekken donkerpaars door het vasthouden van de primaire kleurstof genaamd Crystal Violet in de celwand.

Voorbeeld: Staphylococcus aureus

Fig: Gram positieve bacteriën

2. Gram-negatieve bacteriën: Vlekken rood of roze door het vasthouden van de tegenkleuring kleurstof genaamd Safranin.

Voorbeeld: Escherichia coli

Fig: Gram negatieve bacteriën

Bacteriële Morfologie:

Bacteriën zijn zeer kleine eencellige micro-organismen die alomtegenwoordig zijn in de natuur. Ze zijn micrometers (1µm = 10-6 m) groot. Zij hebben celwanden die bestaan uit peptidoglycaan en planten zich voort door binaire deling. Bacteriën verschillen in hun morfologische kenmerken.

De meest voorkomende morfologieën zijn:

Coccus (pleura: Cocci):

Bolvormige bacteriën; kunnen voorkomen in paren (diplococci), in groepen van vier (tetracocci), in druifachtige clusters (Stafylococci), in kettingen (Streptococci) of in kubusvormige ordeningen van acht of meer (sarcinae).

Bijvoorbeeld: Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes

Bacillus (pleura: Bacilli):

Staafvormige bacteriën; komen meestal afzonderlijk voor, maar kunnen soms in paren (diplo-bacilli) of ketens (streptobacilli) worden aangetroffen.

Bijvoorbeeld: Bacillus cereus, Clostridium tetani

Spirillum (pleura: Spirilla):

Spiraalvormige bacteriën

Bijv: Spirillum, Vibrio, Spirochete soorten.

Sommige bacteriën hebben andere vormen zoals:

Coccobacillen: Langwerpige bolvormige of eivormige vorm.

Filamenteus: Bacillen die in lange ketens of draden voorkomen.

Fusiform: Bacillen met taps toelopende uiteinden.

Fig: Verschillende bacteriële morfologie

Gram Stain Mechanism:

Gram Positive Cell Wall:

Gram-positieve bacteriën hebben een dikke gaasachtige celwand die bestaat uit peptidoglycaan (50-90% van de celwand), dat paars vlekt. Peptidoglycaan is hoofdzakelijk een polysacharide dat bestaat uit twee subeenheden, N-acetylglucosamine en N-acetylmuraminezuur. Naarmate aangrenzende lagen peptidoglycaan worden gevormd, worden zij door middel van een transpeptidase-enzym met elkaar verbonden door korte ketens van peptiden, waardoor de vorm en de stijfheid van de celwand worden verkregen. De dikke peptidoglycaanlaag van Gram-positieve organismen stelt deze organismen in staat het kristalviolet-joodcomplex vast te houden en kleurt de cellen paars.

Lipoteichoïnezuur (LTA) is een ander belangrijk bestanddeel van de celwand van Gram-positieve bacteriën dat in de peptidoglycaanlaag is ingebed. Het bestaat uit teichoëzuren, lange ketens van ribitolfosfaat, die via een glyceride aan de lipidebilaag zijn verankerd. Het fungeert als regulator van autolytische wandenzymen (muramidases: Bacteriële enzymen die zich in de celwand bevinden en na verwonding of dood uiteenvallen van de cel veroorzaken.)

Medische Relevantie van Gram Positieve Celwand:

LTA heeft ook antigene eigenschappen die specifieke immuunreacties stimuleren wanneer het vrijkomt uit de celwand na celdood. Celdood is mailnly het gevolg van lysis geïnduceerd door lysozymale activiteiten, kationische peptiden van leucocyten, of beta-lactam antibiotica.

Gramnegatieve celwand:

Gramnegatieve bacteriën hebben een dunnere laag peptidoglycaan (10% van de celwand) en verliezen het kristalviolet-joodcomplex bij ontkleuring met de alcoholspoeling, maar behouden de tegenkleuring Safranine, waardoor ze er roodachtig of roze uitzien. Zij hebben ook een bijkomend buitenmembraan dat lipiden bevat en dat van de celwand is gescheiden door een periplasmatische ruimte.

Medische relevantie van Gram-negatieve celwand:

De celwand van Gram-negatieve bacteriën is vaak een virulentiefactor die pathogene bacteriën in staat stelt ziekten te veroorzaken. De virulentie van Gram-negatieve bacteriën wordt vaak in verband gebracht met bepaalde componenten van de celwand, in het bijzonder het lipopolysaccharide (ook bekend als LPS of endotoxine). Bij de mens wekt LPS een aangeboren immuunrespons op die wordt gekenmerkt door cytokineproductie en activering van het immuunsysteem. Ontsteking treedt op als gevolg van cytokineproductie, die ook gastheertoxiciteit kan veroorzaken.

Stain Reactie:

De vier basisstappen van de Gram Stain zijn:

1) Aanbrengen van de primaire vlek Crystal Violet (CV) op een warmte gefixeerde uitstrijkje van een bacteriecultuur.

CV splitst in waterige oplossingen in CV+ en Cl – ionen. Deze twee ionen dringen vervolgens door de celwand en het celmembraan van zowel Gram-positieve als Gram-negatieve cellen. De CV+ ionen gaan later een wisselwerking aan met negatief geladen bacteriële componenten en kleuren de bacteriële cellen paars.

2) Toevoeging van Gram’s jodium.

Jodium (I – of I3 -) werkt als beitsmiddel en als vangmiddel. Een beitsmiddel is een stof die de affiniteit van de celwand voor een kleurstof verhoogt door zich te binden aan de primaire kleurstof, waardoor een onoplosbaar complex wordt gevormd dat in de celwand wordt opgesloten. Bij de Gram-kleuring vormen kristalviolet en jodium een onoplosbaar complex (CV-I) dat dient om de uitstrijk een donkerpaarse kleur te geven. In dit stadium zullen alle cellen paars kleuren.

3) Ontkleuring met 95% ethylalcohol.

Alcohol of aceton lost het lipide buitenmembraan van Gram-negatieve bacteriën op, waardoor de peptidoglycaanlaag bloot komt te liggen en de porositeit van de celwand toeneemt. Het CV-I-complex wordt dan weggespoeld van de dunne peptidoglycaanlaag, waardoor Gram-negatieve bacteriën kleurloos blijven.

Anderzijds heeft alcohol een dehydraterend effect op de celwanden van Gram-positieve bacteriën, waardoor de poriën van de celwand krimpen. Het CV-I-complex wordt stevig gebonden in de meerlagige, sterk vernette Gram-positieve celwand, waardoor de cellen paars gekleurd worden.

De ontkleuringsstap moet zorgvuldig worden uitgevoerd, anders kan te veel ontkleuring optreden. Deze stap is kritisch en moet correct worden getimed, anders zal de kristalvioletkleuring uit de Gram-positieve cellen worden verwijderd. Indien het ontkleuringsmiddel te lang op de cel wordt aangebracht, zullen de Gram-positieve organismen er Gram-negatief uitzien. Onderkleuring treedt op wanneer de alcohol niet lang genoeg wordt gelaten om het CV-I complex uit de Gram-negatieve cellen te wassen, waardoor Gram-negatieve bacteriën Gram-positief lijken.

4) Tegenkleuring met Safranine

De ontkleurde Gram-negatieve cellen kunnen zichtbaar worden gemaakt met een geschikte tegenkleuring, die meestal positief geladen safranine is, dat hen roze kleurt. De roze kleur die aan de Gram-positieve bacteriën kleeft, wordt gemaskeerd door het paars van het kristalviolet (in zeldzame situaties wordt soms basisfuschine gebruikt in plaats van safranine).