INTRODUCTION
Ibuprofen behoort tot de groep van niet-steroïde anti-inflammatoire geneesmiddelen (NSAID’s) die worden gebruikt bij de behandeling van diverse ontstekingsprocessen, pijn of koorts. Het mechanisme dat ten grondslag ligt aan de effecten van ibuprofen komt voort uit de remming van de activiteit van cyclooxygenase (COX), die nodig is voor de synthese van prostaglandinen (PG).1 PG worden geproduceerd uit arachidonzuur dat van het plasmamembraan afkomstig is, en de lokale PG-productie heeft hormoonachtige effecten. In menselijke weefsels komen twee COX-isovormen tot expressie: de constitutief tot expressie komende COX-1-isovorm komt in de meeste weefsels voor, terwijl de COX-2-isovorm sterk geïnduceerd wordt tijdens de ontstekingsreactie, met inbegrip van pathologische aandoeningen van chronische ontsteking en darmkanker.2 Onder de verschillende van COX-2 afgeleide producten worden de hoogste PGE2 niveaus gevonden in tumoren en beïnvloeden verschillende processen, waaronder celproliferatie en apoptose.3 In de normale fysiologie speelt PGE2 een rol in het onderhoud van het gastro-intestinale slijmvlies dat processen reguleert, zoals mucussecretie en bloedvatverwijding.4 Langdurige NSAID behandeling kan dus leiden tot bijwerkingen, waaronder intestinale bloedingen. De meeste NSAID’s, waaronder ibuprofen, remmen beide COX-isovormen.
Profylactisch gebruik van NSAID’s vermindert aantoonbaar het risico op overlijden aan colorectale kanker.5-9 Zo bleek een dagelijkse dosis aspirine van 300 mg over een periode van 10 jaar een statistisch significant beschermend effect te hebben.7,10,11 Een vergelijkbare risicovermindering werd gemeld met een dagelijkse dosis ibuprofen van 200 mg8,11-19 voor verschillende tumortypes: 51% risicoreductie voor colonkanker, 72% voor borstkanker, 62% voor prostaatkanker en 59% voor longkanker.19
HOE PREVENT IBUPROFEN KANKER?
Er zijn steeds meer aanwijzingen dat ontsteking de tumorigenese bevordert,20,21 in het bijzonder wanneer het weefsel onder chronische ontstekingsomstandigheden verkeert. Binnen de tumormicro-omgeving wisselen ontstekingscellen signalen uit met tumorcellen. Stromale cellen scheiden overlevingsfactoren voor tumorcellen af, terwijl tumorcellen cytokines produceren, die de proteolytische hermodellering van de extracellulaire matrix door stromale cellen of de vorming van nieuwe bloedvaten in gang zetten.20,22 Ibuprofen remt de COX-activiteit en de daaropvolgende generatie van ontstekingsbevorderende PG; men denkt dat deze actie ten grondslag ligt aan het chemopreventieve effect van ibuprofen. PGE2 activeert bijvoorbeeld G-eiwitgekoppelde PGE2-receptoren die verschillende signaalwegen stimuleren die betrokken zijn bij celproliferatie en -overleving.23,24
In dit artikel bespreken de auteurs aanvullende werkingsmechanismen die onafhankelijk zijn van COX-2 remming, met als doel het bewustzijn te vergroten dat de klinische effecten van ibuprofen gemedieerd kunnen worden door verschillende cellulaire processen. Het gepresenteerde bewijsmateriaal werd opgehaald uit de PubMed zoekmachine met “ibuprofen AND cancer” als zoekterm. Studies die COX-onafhankelijke effecten rapporteerden, waaronder die welke in het laboratorium van de auteurs werden uitgevoerd, werden geselecteerd voor beoordeling.
ADDITIONELE MECHANISMEN WAAROP IBUPROFEN TUMORCELLEN MIDDELT
In 2015 evalueerden Matos en Jordan25 de behandeling van kankercellen met ibuprofen. HCT-116 colorectale cellen brengen geen COX-2 tot expressie, maar de behandeling met 2 mMol/L ibuprofen veroorzaakte proapoptotische effecten.26 Ibuprofen in een lage concentratie van 100 µMol werd verder geïdentificeerd als een direct en COX-onafhankelijk ligand van peroxisome proliferator-activated receptor gamma (PPARγ),27 en er werd aangetoond dat het de nucleaire activiteit ervan stimuleert in rattenmodellen van de vorming van darmkanker.28 De pro-apoptotische werking van ibuprofen kan dus deels het gevolg zijn van PPARγ-activering, die leidt tot de downregulatie van de anti-apoptotische transcriptiefactor NFκB.28
Een andere COX-onafhankelijke cellulaire respons na ibuprofen-behandeling zou betrekking hebben op P75NTR, een lid van de TNF-receptor superfamilie. Behandeling van kankercellen met 1 mMol/L ibuprofen resulteerde in een p38 mitogen-activated protein kinase pathway-afhankelijke stabilisatie van p75NTR mRNA stabiliteit, wat leidde tot verhoogde expressieniveaus29 en inductie van apoptose en groeionderdrukking.30
Een vergelijkbare apoptose-bevorderende werking werd gerapporteerd in HCT116 cellen, toen ibuprofen behandeling (1,5 mM gedurende 24 uur) deze cellen gevoelig bleek te maken voor het TNF-gerelateerde apoptose-inducerende ligand.31 Het onderliggende mechanisme betrof expressie van de membraanreceptor voor TNF-gerelateerd apoptose-inducerend ligand: doodreceptor 5, een ander lid van de TNF-receptor superfamilie.
Ibuprofen behandeling (1 mMol/L gedurende 24 uur) bleek verder de nucleaire niveaus van β-catenine in SW480 en DLD-1 colorectale tumorcellen significant te verminderen. Dienovereenkomstig werd de expressie van een van zijn transcriptionele doelen, het pro-proliferatieve cycline D1 gen, onderdrukt.32 Hoewel het onderliggende mechanisme nog moet worden vastgesteld, lijkt dit effect van ibuprofen van speciaal belang voor de preventie van colorectale kanker, omdat overmatige β-catenine signalering kan leiden tot ongepaste groeistimulatie van colon mucosa stamcellen.33
Naast het effect op β-catenine signalering, interfereerde ibuprofen ook direct met de NFκB route. Een snel effect van ibuprofenbehandeling dat in cellen werd waargenomen, is de remmende fosforylering van GSK-3β op serine 9.32 Deze modificatie bleek de NFκB-signalering negatief te reguleren, in een stap stroomafwaarts van de afbraak van het remmende eiwit IkBα, en de expressie van anti-apoptotische NFκB-doelgenen, zoals BCL2 en BIRC5, te onderdrukken.
Andere voorbeelden van COX-onafhankelijke effecten van 100 µMol ibuprofen zijn de remming van de integrine-expressie in neutrofielen34 of de caspase-gemedieerde afgifte van proinflammatoire cytokinen in HCT-116- en HeLa-cellen.35
IBUPROFEN, ALTERNATIE SPLICING, EN KANKER
Kankercellen verschillen in hun genexpressieprogramma van hun overeenkomstige gedifferentieerde normale cellen. Naast transcriptionele regulatie aan genpromotors, hebben de laatste 15 jaar duidelijk aangetoond dat alternatieve splicing een belangrijk mechanisme is voor de regulatie van genexpressie. Zo genereert alternatieve splicing transcript varianten die ofwel niet functioneel zijn en snel worden afgebroken, ofwel vertaald worden in eiwit isovormen met verschillende, soms antagonistische, functionele eigenschappen als gevolg van verschillend gebruik van functionele eiwit domeinen.36,37
Recentelijk werd remming van de alternatieve splicingvariant RAC1b geïdentificeerd als een ander COX-onafhankelijk effect van ibuprofen.38 Colonontsteking werd aangetoond als een trigger voor verhoogde expressie van het tumorgerelateerde RAC1b eiwit, een splice-variant van het kleine GTPase RAC1. Het RAC1b eiwit bevat een extra domein dat wordt gecodeerd door een 57 basisparen lang alternatief exon (exon 3b), dat een verhoogde activering van het eiwit veroorzaakt, waardoor een hyperactieve variant ontstaat die in staat is de NFκB signalering te stimuleren.39-42 Wanneer colorectale cellen werden behandeld met ibuprofen, maar niet met aspirine of flurbiprofen, werden zowel het mRNA- als het eiwitgehalte van RAC1b in vitro en in vivo duidelijk verlaagd.38 Terwijl in veel studies naar het effect van NSAID’s op de levensvatbaarheid van tumorcellen concentraties tot 2 mMol/L werden gebruikt,43 werd het effect van ibuprofen op alternatieve splicing van RAC1b al waargenomen bij lage doses van 100 µMol. Interessant is dat ibuprofen de RAC1b-positieve HT29 colorectale cellen meer remde dan normale colonocyten en ook hun groei als subcutane tumorxenotransplantaten bij muizen beïnvloedde. Het remmende effect van ibuprofen kon worden opgeheven wanneer een splitsingsonafhankelijke RAC1b cDNA-sequentie tot expressie werd gebracht in HT29-cel.38 Dit suggereert dat ibuprofen direct inwerkt op de alternatieve splicinggebeurtenis.
Een ander rapport over de modulatie van alternatieve splicing werd verkregen toen prostaatkankercellen een gecombineerde behandeling kregen van ibuprofen en epigallocatechin-3-gallate (EGCG), een bestanddeel van groene thee met anticarcinogene eigenschappen dat de G0/G1 celcyclusstilstand en apoptose bevordert. In dit geval werd de balans tussen anti en proapoptotische splicing varianten van BCL-X en MCL-1 verschoven naar de kortere en proapoptotische BCL-X(S) of MCL-1(S) varianten.44 Hoewel het mechanisme niet volledig werd geïdentificeerd, impliceert het de activering van proteïne fosfatase PP1, waarvan bekend is dat het regulerende proteïnen defosforyleert die betrokken zijn bij pre-mRNA splicing.
MECHANISME VAN SPLICING MODULATIE DOOR IBUPROFEN
Wanneer proteïne-coderende genen tot expressie komen in menselijke cellen, genereert RNA polymerase 2 een primair transcript, het pre-mRNA, dat coderende exonen bevat, gescheiden door intronic sequenties. Tijdens de transcriptie worden geconserveerde nucleotidesequenties rond elke exon-intron junctie herkend door het spliceosoom, een macromoleculaire machinerie bestaande uit vijf kleine nucleaire ribonucleoproteïnedeeltjes (U1, U2, U4, U5, en U6 kleine nucleaire ribonucleoproteïne),45,46 die vervolgens introns verwijdert tijdens het proces van mRNA-splicing. De functie van het spliceosoom wordt ondersteund door splice enhancer- of silencer-elementen, korte sequenties die in exonen of intronen worden aangetroffen en die de productieve herkenning van een bepaald exon door het spliceosoom bevorderen of afremmen. Splicing-factoren herkennen deze splice enhancer- of silencer-elementen, die meestal behoren tot de familie van serine- en argininerijke eiwitten of de heterogene nucleaire ribonucleoproteïnen. Vaak werken zij antagonistisch, zodat de modulatie van de binding een mechanisme verschaft dat het opnemen of overslaan van alternatieve exonen en dus het genereren van transcriptievarianten mogelijk maakt. Alles bij elkaar werken de reeks splicingfactoren die in een bepaalde cel tot expressie komen en hun relatieve expressieniveaus in de celkern op een combinatorische wijze om alternatieve splicing te reguleren.
In het geval van RAC1b wordt de alternatieve splicing gereguleerd door een enhancer-element in exon 3b, dat wordt herkend door de splicing-factor SRSF1, en een aangrenzend silencer-element dat wordt herkend door SRSF3.47
In menselijke colorectale cellen is de beschikbaarheid van SRSF1 in de celkern de belangrijkste factor die het opnemen of overslaan van exon 3b regelt.48
Eén mechanisme waardoor ibuprofen de alternatieve splicing in cellen beïnvloedt, is de fosforylatiestatus van SRSF1. Uit celfractionerings- en immunoblot-experimenten bleek dat ibuprofenbehandeling een vermindering van de fosforylering van SRSF1 veroorzaakte (ongepubliceerde gegevens). Aspirine behandeling had daarentegen geen dergelijk effect op SRSF1. Hieruit bleek dat het remmende effect van ibuprofen op RAC1b splicing post-translationele regulatie van SRSF1 subcellulaire lokalisatie betrof.48
Het belangrijkste eiwit kinase verantwoordelijk voor SRSF1 fosforylering is SRPK1, dat zich zowel in het cytoplasma als in de celkern bevindt.49,50 Dit proces wordt gedeeltelijk gecontroleerd door groeifactor receptor signalering.51 Zoals getoond en beschreven in figuur 1, stelden de auteurs vast dat ibuprofen behandeling translocatie van SRPK1 van de kern naar het cytoplasma induceerde, en dit correleerde met verminderde niveaus van SRSF1 fosforylering en RAC1b proteïne zoals gedetecteerd in hele cellysaten door middel van Western blot. Een dergelijk effect werd niet waargenomen wanneer de cellen onder dezelfde omstandigheden met aspirine werden behandeld, hetgeen de COX-onafhankelijke werking van ibuprofen en de specificiteit van het effect op de modulatie van de splicingfactoren onderstreept.