Die Kopienzahl der methylierten O6-Methylguanin-DNA-Methyltransferase (MGMT) wird im Verhältnis zur Kopienzahl von Beta-Actin (ACTB) durch methylierungsspezifische Polymerasekettenreaktion (MSP) in Echtzeit bestimmt. Zu diesem Zweck wird das Tumorgewebe durch manuelle Mikrodissektion und anschließende DNA-Extraktion angereichert. Die DNA wird mit Picogreen quantifiziert und durch Bisulfit-Behandlung modifiziert, wodurch unmethylierte Cytosine in Uracyl umgewandelt werden, während methylierte Cytosine unverändert bleiben. Anschließend wird eine methylierungsspezifische Echtzeit-PCR (MSP) auf dem Quantstudio 5-Gerät durchgeführt, um die Kopienzahl von MGMT und ACTB zu quantifizieren (1). Diese Technik besteht in der Durchführung einer PCR mit Echtzeit-Detektion unter Verwendung des Amplifluor-Detektionssystems. Proben mit unbekannter Kopienzahl können durch Vergleich ihrer Ct-Werte mit denen einer Plasmid-Standardkurve quantifiziert werden.
Klinische Implikation
MGMT ist ein DNA-Reparaturenzym, das bei menschlichem Krebs häufig durch Hypermethylierung deaktiviert wird. Wenn es den Zellen an MGMT-Aktivität mangelt, werden DNA-Schäden nicht ordnungsgemäß repariert, so dass ein Individuum anfälliger für die Entwicklung von Krebs ist. Interessanterweise macht dieser Mangel an MGMT-Aktivität eine Tumorzelle auch empfindlicher gegenüber Strahlentherapie und bestimmten alkylierenden Medikamenten wie Temozolomid (2). In der internationalen prognostischen Phase-III-Validierungsstudie (RTOG 0525) identifizierte der MGMT-Assay erfolgreich neu diagnostizierte Glioblastom-Patienten, die nach einer Behandlung mit Temozolomid mit höherer Wahrscheinlichkeit länger leben und eine längere progressionsfreie Zeitspanne aufweisen (3-5). Kürzlich wurde eine neue Publikation veröffentlicht, in der sowohl methylierte als auch „Grauzonen“-Patienten in Bezug auf das Gesamtüberleben deutlich besser abschnitten als wirklich unmethylierte Patienten (6).
Probenanforderungen
Zulässige Proben für den Test sind in Formalin fixierte, in Paraffin eingebettete Gliomgewebeproben mit einer Fixierungszeit von 6-48 Stunden.
Volumen
Ein repräsentativer Paraffinblock wird bevorzugt. Alternativ werden 5 ungefärbte Gewebeschnitte akzeptiert (1 Objektträger mit einer Dicke von 5 µm für die H&E-Färbung und mindestens 4 Objektträger mit einer Dicke von 5-10 µm für den MGMT-Test).
Lagerungs- und Versandanweisungen
Lagern und versenden Sie die Proben bei Raumtemperatur.
Einschränkungen
Bei einigen Proben wird aufgrund einer unzureichenden Anzahl von ACTB-Kopien in Kombination mit einer Anzahl von MGMT-Kopien unterhalb der Nachweisgrenze ein ungültiges Ergebnis erzielt. In den meisten Fällen ist dies auf eine unzureichende DNA-Menge und/oder -Qualität zurückzuführen. Bei ungültigen Proben mit einer MGMT- und/oder ACTB-Kopienzahl, die um die LOD/LOQ und den Cut-off herum liegt, wird empfohlen, einen erneuten Test mit der bisulfitbehandelten DNA durchzuführen. Andere Fixierungsmittel als Formalin oder eine verlängerte Fixierungszeit können zu unzureichenden Ergebnissen führen.
Besondere Anforderungen
Keine
Bearbeitungszeit
Fünf bis sieben Arbeitstage für Objektträger bzw. Paraffinblöcke.
- Vlassenbroeck I et al. Validation of Real-Time Methylation-Specific PCR to determine O6-Methylguanine-DNA Methyltransferase Gene Promotor Methylation in Glioma. J Mol Diagn. 2008 Jul;10(4):332-7
- Hegi ME et al. MGMT gene silencing and benefit from temozolomide in glioblastoma. N Engl J Med 2005 Mar 10;352(10):997-1003.
- Gilbert MR et al. Dose-dense temozolomide for newly diagnosed glioblastoma: a randomized phase III clinical trial.(7). J Clin Oncol. 2013 Nov 10;31(32):4085-91.
- Malmström A et al. Temozolomide versus standard 6-week radiotherapy versus hypofractionated radiotherapy in patients older than 60 years with glioblastoma: the Nordic randomised, phase 3 trial. Lancet Oncol 2012 Sep; 13(9): 916-926.
- Wick W et al. Temozolomide chemotherapy alone versus radiotherapy alone for malignant astrocytoma in the elderly: the NOA-08 randomised, phase 3 trial. Lancet Oncol 2012 Jul; 13(7): 707-715.
- Hegi ME et al. MGMT Promoter Methylation Cutoff with Safety Margin for Selecting Glioblastoma Patients into Trials Omitting Temozolomide. A Pooled Analysis of Four Clinical Trials. Clin Cancer Res 2019 Mar 15; 25(6): 1809-1816.
Aktualisiert am 23. Mai 2019