Mechanismus der synergistischen Aktinfilament-Spitzendendepolymerisation durch Cyclase-assoziiertes Protein und Cofilin

DNA-Konstrukte

Alle Maus N-CAP-Proteine, N-CAP-GFP, CAP1 in voller Länge, die HFD-Domäne, die GST-Fusion der HFD-Domäne und die C-terminale ADF-H-Domäne von Twinfilin wurden in den bakteriellen Expressionsvektor pSUMOck4 (ein freundliches Geschenk von Inari Kursula, Universität Bergen, Norwegen) kloniert, um ein SUMO-markiertes Fusionsprotein zu exprimieren, das nach der Spaltung mit der SENP2-Protease einen nativen N-Terminus hinterlässt. Für die CARP-Domäne und die C-CAP-Konstrukte verwendeten wir den bakteriellen Expressionsvektor pCoofy18 (ein freundliches Geschenk von Addgene). Einzelheiten zu den Proteinkonstrukten und den für die Klonierung der Konstrukte verwendeten Primern finden Sie in der ergänzenden Tabelle 2.

Expression und Reinigung der CAP-Proteine und ihrer Fragmente

Alle Maus-CAP-Proteine und ihre Fragmente, mit Ausnahme von CAP1 in voller Länge, wurden bei +22 °C in LB-Autoinduktionsmedien (AIMLB0210, Formedium) für 24 h in BL21(DE3) E. coli (von Novagen) exprimiert.

Maus-CAP1 in voller Länge wurde in LB-Medium unter Verwendung von ArcticExpress (DE3) E. coli-Zellen exprimiert. Zunächst wurde eine Starterkultur mit Kanamycin (20 µg/ml) und Gentamycin (20 µg/ml) beimpft, die 6 h bei +37 °C inkubiert wurde. Die 3,6-l-Hauptkultur, die nur Kanamycin (20 µg/ml) enthielt, wurde beimpft und bei +37 °C unter Schütteln bei 240 U/min auf eine OD600 von ~0,4 gezüchtet. Die Kulturtemperatur wurde vor der Proteinexpression, die durch Zugabe von 0,26 mM IPTG für 46 h induziert wurde, für 1 h auf +13 °C geändert. Alle Bakterienpellets wurden durch Zentrifugation gesammelt, in 50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 25 mM Imidazol, pH 7,5, resuspendiert, mit flüssigem N2 eingefroren und bei -80 °C gelagert.

Alle CAP-Proteine und die ADF-H-Domäne von Twinfilin wurden nach einem ähnlichen Verfahren gereinigt. Zunächst wurden die Bakterien in Gegenwart von Lysozym (0,5 mg/ml), DNAse (0,1 mg/ml) und Proteaseinhibitoren (200 µg/ml PMSF, 1 µg/ml Leupeptin, 1 µg/ml Aprotinin, 1 µg/ml Pepstatin A; alle von Sigma-Aldrich) durch Beschallung lysiert, und das Lysat wurde durch Zentrifugation geklärt. Der Überstand wurde in eine 1 ml HisTrap HP Ni-NTA-Säule (GE Healthcare) geladen und ausgiebig gewaschen (>20 Säulenvolumina) mit 50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 25 mM Imidazol, pH 7,5. Das Protein wurde mit einem 25-250 mM Imidazol-Gradienten auf der AKTA Pure-Maschine (GE Healthcare) eluiert. Die Peak-Fraktionen wurden gepoolt und die SENP2-Protease wurde zur Entfernung des SUMO-Tags in einer Endkonzentration von 40 µg/ml zugegeben. Das Gemisch wurde bei 4 °C unter Verwendung von SnakeSkin-Dialyseschläuchen in 1 l 20 mM HEPES, 300 mM NaCl, 2 mM DTT, pH 7,4-Puffer dialysiert (O/N). Am nächsten Tag wurden die gespaltenen SUMO-Tags mit Ni-NTA-Agarose-Perlen (Qiagen) entfernt, wenn SUMO-Tag und gespaltenes Protein gleich groß waren. Die Proteine wurden mit einem Amicon Ultra-4 10 kDa Zentrifugalfilter (Merck) konzentriert und in eine HiLoad 16/600 Superdex 200 Gelfiltrationssäule (GE Healthcare) geladen, die in 5 mM HEPES, 100 mM NaCl, 1 mM DTT, pH 7,4 äquilibriert wurde. Die Peak-Fraktionen wurden gesammelt, konzentriert und durch Einfrieren in N2 für die Lagerung bei -80 °C eingefroren.

Das CAP in voller Länge wurde mit folgenden Ausnahmen gereinigt. Es wurde eine 5 ml HisTrap HP Ni-NTA-Säule anstelle einer 1 ml-Säule verwendet. Nach Dialyse und Gelfiltration mit der HiLoad 16/60 Superdex 200 Gelfiltrationssäule wurden die Hauptpeakfraktionen über die Superose 6 increase 10/300 GL Gelfiltrationssäule geleitet, um eine bessere Trennung der Mischung oligomerer Zustände zu erreichen. Schließlich wurden die Hauptpeaks aus mehreren Läufen kombiniert, bei 5-minütigen Spin-Intervallen unter Verwendung eines Amicon Ultra-4 30 kDa Zentrifugalfilters konzentriert und wie oben beschrieben gelagert. CARP- und C-CAP-Proteine wurden wie oben beschrieben gereinigt, mit Ausnahme der Verwendung von 3C-Protease (0,01 mg/ml) für die Tag-Spaltung.

Andere Proteine

Kaninchenmuskel-Aktin, markierte Aktine, Profilin, Maus-Cofilin-1, Capping-Protein und Biotin-Gelsolin wurden wie in Ref. 16. ADP-Actin wurde wie in der Referenz beschrieben hergestellt. 34. Kurz gesagt, 30 µM ATP-G-Actin-Lösung mit 0,3 mM Glukose und 1 Einheit/ml Hexokinase (Sigma) wurde gegen Nukleotid-Austauschpuffer (5 mM Tris-HCl, 0,1 mM MgCl2, 0,05 mM EGTA, 0,2 mM ADP, 1 mM DTT, pH 8,0) für 4 h bei 4 °C dialysiert. Alle Experimente wurden mit α-Actin aus Kaninchenmuskeln durchgeführt.

Actinspitzen-Depolymerisationsassays

Die Messung der Depolymerisationsrate der Aktinfilamentspitzen wurde mit einem Mikrofluidikgerät in Verbindung mit einem Mikroskopieaufbau durchgeführt, wie beschrieben16. Kurz gesagt, wir haben eine Kammer mit Polydimethylsiloxan (PDMS, Sylgard) vorbereitet, die auf ein gereinigtes Deckglas montiert wurde. Die mikrofluidischen Kammern waren 20 µm hoch. Die drei Einlässe und der Auslass waren mit druckgesteuerten Röhren verbunden, die mit Lösungen unterschiedlicher biochemischer Zusammensetzung gefüllt waren (Fluigent-Mikrofluidikgerät).

Nach der Montage wurden die Kammern mit dH20 und F-Puffer (5 mM HEPES pH 7,4, 100 mM KCl, 1 mM MgCl2, 0,2 mM EGTA, 0,4 mM CaCl2, 0,2 mM ATP, 10 mM DTT und 1 mM DABCO) gespült. Die Kammer wurde dann nacheinander folgenden Substanzen ausgesetzt: 150 µl 0,1% Biotin-BSA in F-Puffer; 300 µl 5% BSA; 150 µl 3 µg/ml Neutravidin in F-Puffer; und 10-100 µl 1-3 pM Biotin-Gelsolin. Vor den Experimenten wurden die Aktinfilamente in F-Puffer polymerisiert (8 µM, >30 min). Eine Fraktion der Aktinmonomere wurde mit Alexa-488 oder 568 markiert. Die Filamente wurden schließlich in die Kammer injiziert und mit den Gelenolinen bis zur gewünschten Dichte auf dem Deckglas verankert.

Um die Depolymerisationsrate von mit Cofilin dekorierten spitzen Enden zu messen, wurden die Filamente zunächst mit 2 µM Cofilin gesättigt und dann 2 µM Cofilin, ergänzt durch verschiedene CAP-Proteine, ausgesetzt. Die Depolymerisationsrate wurde mit ImageJ analysiert, indem zunächst ein Kymograph für jedes Filament erstellt (Funktion reslice) und manuell eine Steigung entlang des spitzen Endes angepasst wurde. Filamente, deren spitze Enden nicht eindeutig verfolgt werden konnten oder die möglicherweise (un)beobachtete Pausen53 oder Abtrennungsereignisse aufwiesen, wurden aus der Analyse ausgeschlossen.

Um die Auswirkungen der Proteinmarkierung auf unsere Messungen zu minimieren, verwendeten wir je nach Mikroskopieaufbau entweder 10 % oder 16 % Markierungsanteil von Aktin. In unseren Experimenten konnten wir keine Auswirkungen des Markierungsanteils auf die N-CAP-Aktivität feststellen. Alle Experimente wurden bei Raumtemperatur in einem nicht temperaturgesteuerten Aufbau durchgeführt.

Reannealing von Aktinfilamenten

Vorbereitete, stationäre F-Actin-Lösungen (in F-Puffer) mit verschiedenen Fluoreszenzmarkern wurden gemischt und inkubiert, um das Reannealing zu quantifizieren. Die gemischte Lösung enthielt 4 µM Alexa568-Actin (10 % markiert) und 4 µM Alexa488-Actin (10 % markiert), mit oder ohne N-CAP und Mutanten. Nach 4 Minuten bei Raumtemperatur wurde die gemischte F-Actin-Lösung 100-fach in mit 0,2 % Methylcellulose angereichertem Puffer verdünnt und in eine mit doppelseitigem Klebeband zwischen zwei Deckgläsern hergestellte und mit BSA passivierte offene Kammer geleitet. Bildserien (2 s Intervall) wurden in mindestens drei verschiedenen Sichtfeldern aufgenommen. Gezählt wurde die Anzahl der grünen (Alexa488) F-Aktin-Segmente sowie die Anzahl dieser Segmente, die mit einem roten (Alexa568) F-Aktin-Segment verbunden waren, um das in Abb. 2f dargestellte Verhältnis der beiden Farbsegmente zu bestimmen. Die Beobachtung der Diffusion der Filamente ermöglichte es uns, eindeutig zu bestimmen, wann zwei Segmente miteinander verbunden waren. Die Kontrollen (ohne N-CAP in der F-Actin-Mischung) wurden mehrmals, die Experimente (mit N-CAP oder Mutanten) mindestens zweimal wiederholt.

Actinabtrennungsassays

Um den Einfluss von N-CAP auf die Abtrennung durch Cofilin zu untersuchen, verwendeten wir zwei verschiedene Methoden, entweder (1) durch Messung des Anteils einzelner Cofilin-Domänen, die noch nicht zu einer Abtrennung geführt haben, oder durch (2) Quantifizierung der Gesamtzahl der Abtrennungsereignisse pro µm Aktinfilament.

(1) Abtrennung in Verbindung mit einzelnen Cofilin-Domänen (ergänzende Abb. 3c). Wir folgten dem zuvor beschriebenen Verfahren16. Kurz gesagt, in einer mikrofluidischen Kammer wurden 12% Alexa-488-markierte Aktinfilamente aus Spectrin-Actin-Seeds polymerisiert, die unspezifisch an einem BSA-passivierten Deckglas verankert waren. Die Filamente wurden 15 Minuten lang mit einer Lösung von G-Actin in kritischer Konzentration (100 nM G-Actin) gealtert, so dass die Filamente >99% ADP46 wurden. Die Filamente wurden dann kontinuierlich mit 500 nM mCherry-Cofilin-1 allein, mit 2 µM CAP1 in voller Länge oder mit 10 µM N-CAP behandelt. Mit ImageJ wurden dann Kymogramme der Filamente erstellt, um die Keimbildung und den Zusammenbau einzelner Cofilin-Domänen und die Abtrennung an der Schnittstelle zu bloßen Aktin-Segmenten zu verfolgen.

Für jede Domäne wurde der Zeitpunkt 0 auf das Bild festgelegt, auf dem sie sich bildeten. Dann wurde entweder der Zeitpunkt aufgezeichnet, an dem sie ein Abtrennungsereignis auslösten, oder wann sie durch eine Abtrennung durch eine andere Domäne, eine Verschmelzung oder ein Zensierungsereignis verloren gingen. Der Anteil der Domänen, die kein Abtrennungsereignis ausgelöst haben, wurde dann mit einer klassischen Kaplan-Meier-Methode berechnet.

(2) Gesamtzahl der Abtrennungsereignisse/µm (ergänzende Abb. 3d). In Fließkammern (zwischen zwei mit doppelseitigem Klebeband beabstandeten Deckgläsern) injizierten wir zunächst vorpolymerisierte Alexa-488-markierte Filamente (in F-Puffer, mit 0,2-0,3% Methylcellulose). Die Lösung wurde dann mit 500 nM unmarkiertem Cofilin-1 und 0, 1 oder 10 µM NCAP ausgetauscht. Nach dem Austausch wurden die Filamente, die in der Nähe der Oberfläche verblieben, wie folgt analysiert.

Die Anzahl der Abtrennungsereignisse pro µm wurde als kumulative Funktion berechnet

wobei Nsev(u) die Anzahl der Abtrennungsereignisse zum Zeitpunkt u ist, und \(\mathop {\sum}\nolimits_i {l_{i(u)}}\) die Summe über alle Filamente i ihrer Länge zum Zeitpunkt u ist. Da die Lösung kein G-Actin enthält, depolymerisieren die Filamente, so dass die Filamentlänge im Laufe der Zeit abnimmt.

Bindung von N-CAP an die spitzen Enden der Filamente

Das Experiment wurde in Durchflusskammern (siehe Actin severing assay (2)) durchgeführt, die mit Biotin-PLL-PEG passiviert und mit Neutravidin funktionalisiert waren. F-Actin (10 % Alexa-568, 1 % Biotin) wurde über Nacht bei 4 µM polymerisiert. Unmittelbar vor der Injektion in die Kammer wurde F-Actin auf 200 nM verdünnt und mit 100 nM N-CAP-GFP, 2 µM Cofilin-1 und 4 nM Capping-Protein in einem mit 0,2 % Methylcellulose ergänzten F-Puffer gemischt. Bilder von Aktinfilamenten wurden vor und nach einer Stream-Akquisition des GFP-Kanals aufgenommen (5 Bilder/Sekunde über 12 s, TIRF-Mikroskopie). Für die Analyse der Bindung an die Filamentenden wurden Aktinfilamente, die sich während der Stromaufnahme nicht bewegten, blind ausgewählt. Die Fluoreszenz wurde an den beiden Enden jedes Filaments in einem Bereich von 3 x 3 Pixeln gemessen. Ein Bindungsereignis wurde erkannt, wenn die Fluoreszenz einen willkürlichen Schwellenwert überschritt (gleicher Wert für alle Filamente und Filamentenden). Da das Capping-Protein das mit Widerhaken versehene Ende schützen sollte, wurde das spitze Ende als dasjenige mit den meisten Bindungsereignissen eingestuft. N-CAP-GFP wurde in 17 % der Datenpunkte am spitzen Ende des Filaments nachgewiesen, während eine unspezifische Assoziation von N-CAP-GFP in der Nähe des mit Widerhaken versehenen Filamentendes in 1,7 % der Datenpunkte nachgewiesen wurde. Die Überlebensfraktion von N-CAP am spitzen Ende wurde dann berechnet und mit einer einzelnen Exponentialkurve gefittet, um die Entbindungsrate zu messen.

Kristallisation und Strukturbestimmung

Die Maus-HFD-Domäne wurde mit 10×His-Tag kristallisiert und wie oben beschrieben gereinigt, mit Ausnahme der Verwendung von 5 mM HEPES, 50 mM NaCl, 0,2 mM DTT, 0,01% NaN3, pH 7,5-Puffer bei der Gelfiltration. Die Probe wurde vor der Kristallisation auf 7-10 mg/ml konzentriert und im Verhältnis 1:1 mit 0,1 M Natriumcacodylat, 12% PEG4000 (w/v), pH 6,1 in einer sitzenden Tropfenmethode mit einer Tropfengröße von 200 nl im 96-Well-Format gemischt. Nach 2 Wochen Inkubation wurden große nadelartige Kristalle beobachtet. Für die Ferndatenerfassung an der Diamond Light Source (UK, Didgot) an der Beamline I03 wurden die Kristalle durch Einweichen in Mutterflüssigkeit mit 25 % Glycerin kryo-geschützt und für den Transport zur Beamline in N2 eingefroren. Die Daten wurden bei 100 K mit einer Wellenlänge von 0,9763 Å, einem Pilatus3 6M-Detektor, einer Transmissionsleistung von 30 %, einer Belichtungszeit von 0,05 s und einem Oszillationswinkel von 0,1° mit insgesamt 2400 Bildern aufgenommen. Die Beugungsdaten wurden mit der X-ray Detector Software (XDS)54 integriert und skaliert. Die ursprüngliche Lösung wurde durch molekulare Ersetzung mit PHASER55 und PDB = 1s0p als Suchmodell erhalten. Es wurde eine Lösung mit vier HFD-Domänen in einer asymmetrischen Einheit gefunden, nach der mehrere Verfeinerungsrunden mit BUSTER56 und manuellem Aufbau in COOT57 eine gute Anpassung an die Daten ergaben (siehe Tabelle 1). Eine weitere Verbesserung wurde durch die Verfeinerung der Daten durch die Einführung von Translations-Liberations-Schrauben-Parametern (1/Kette), die Entfernung von nicht-kristallographischen Beschränkungen und die Modellierung einzelner atomarer B-Faktoren erreicht. Das endgültige Rwork/Rfree für das Modell betrug 18,6%/23,0% mit einer guten Gesamtgeometrie.

Für die Kristallisation des dreiteiligen Komplexes (aus ADP-Actin, HFD-Domäne von Maus-CAP1 und C-terminaler ADF-H-Domäne von Maus-Twinfilin-1) wurde ADP-Actin in O/N-Dialyse bei +4 °C in 5 mM HEPES, 0.2 mM MgCl2, 0,2 mM ADP, 0,2 mM EGTA, 0,3 mM Glucose, 0,5 mM β-Mercaptoethanol, pH 8,0. Die Aktinlösung, die 0,3 mM Glukose und 5 U/ml Hexokinase enthielt, wurde auf eine Slide-A-Lyser-Dialysemembran übertragen und bei +4 °C auf eine Schwebevorrichtung gelegt. Am nächsten Tag vor der Komplexbildung wurde das Aktin 20 Minuten lang bei 355.040 × g mit dem TLA-120-Rotor zentrifugiert. Die Proteine wurden im Verhältnis 1:1,1:1,1 (Aktin, HFD-Domäne, ADF-H-Domäne) gemischt, auf 10-20 mg/ml konzentriert und wie oben beschrieben zur Kristallisation verwendet. Treffer wurden unter verschiedenen Bedingungen erzielt, und der am besten beugende Kristall wurde bei einer Konzentration von ~10 mg/ml des 1:1 in 0,1 M HEPES, 0,1 mM KCl, 10 % PEG4000 (w/v), pH 7,0 gemischten Komplexes mit einer sitzenden Tropfengröße von 200 nl erzielt. Am ersten Tag erschienen mehrere kleine rautenförmige Kristalle in dem Tropfen. Am dritten Tag erschien ein großer stabförmiger Kristall, während alle kleinen Kristalle aufgelöst wurden. Für die Ferndatenerfassung an der Diamond Light Source (UK, Didgot) an der Beamline I03 wurden die Kristalle durch Einweichen in LV CryoOil (MiTeGen) kryo-geschützt und für den Versand in N2 eingefroren. Die Daten wurden bei 100 K mit einer Wellenlänge von 0,9762 Å, einem Pilatus3 6M-Detektor, 20 % Transmissionsleistung, 0,05 s Belichtung und 0,15° Oszillationswinkel mit insgesamt 2400 Bildern aufgenommen. Die Beugungsdaten wurden mit XDS54 integriert und skaliert. Eine erste Lösung wurde mit molekularer Ersetzung unter Verwendung von PHASER55 und PDB = 3daw als Suchmodell erzielt, das eine deutliche zusätzliche Dichte im spitzen Ende des Aktinmonomers zeigte. Daher wurde eine weitere molekulare Ersetzung durchgeführt und ein erstes Modell für den dreiteiligen Komplex mit BALBES58 mit 3daw und 1s0p als Suchmodelle erstellt. Dies führte zu einer Lösung mit Q = 0,787 und Rwork/Rfree = 29,7%/35,6%. Die asymmetrische Einheit enthielt einen einzelnen 1:1:1-Komplex aus HFD:ADF-H:ADP-Actin. Zur Verbesserung des Modells waren mehrere Verfeinerungsrunden mit BUSTER56 und die manuelle Erstellung in COOT57 erforderlich, insbesondere die Wiederherstellung der D-Schleife und der Verbindungsschleifen der α-Helices in der HFD-Domäne. Schließlich führte die Hinzufügung von Wasser, die Einführung von Translation-Libration-Screw-Parametern (1/Kette) und die Modellierung einzelner atomarer B-Faktoren zu einem Modell mit einem endgültigen Rwork/Rfree von 16,6 %/19,4 % mit einer guten Gesamtgeometrie.

Untersuchung von Protein-Protein-Wechselwirkungen durch Gelfiltration

Für die Untersuchung der Bindung von Aktin-Monomeren wurde ADP-G-Actin wie in Ref. 34. Alle Gelfiltrationsexperimente wurden bei +4 °C mit 0,5 ml/min Laufgeschwindigkeit und 0,5 ml Fraktionierung mit Superdex 200 increase 10/300 GL Gelfiltrationssäule durchgeführt, die in 5 mM HEPES, 100 mM NaCl, 0,1 mM ADP, 0,1 mM MgCl2, 1 mM DTT, pH 7,4 äquilibriert wurde. Einhundert Mikroliter des Komplexes, der 18 µM ADF-H-Domäne von Twinfilin und 15 µM andere Proteine enthält, wurden auf die Säule injiziert und auf Elution analysiert. Die Peak-Fraktionen wurden auch mittels SDS-PAGE analysiert. Die Experimente zur Konkurrenz von Actin-Monomeren wurden wie oben beschrieben durchgeführt, indem 15 µM C-CAP- oder CARP-Domäne in die Proben gegeben wurden. Die Peakfraktionen wurden mittels SDS-PAGE analysiert, die Gele wurden mit dem ChemiDoc XRS + Imaging System (Bio-Rad) abgebildet und mit Image Lab (Bio-Rad) quantifiziert.

Native-PAGE

Mini-Protean TGX 10% Gele (Bio-Rad) wurden vor dem Beladen 1 h lang in gekühltem Laufpuffer (25 mM Tris, 195 mM Glycin, 0,5 mM ADP, 0,1 mM MgCl2, pH 8,5) gelagert. Die Proben wurden in ADP-Actin-Dialysepuffer (5 mM HEPES oder Tris, 0,1 mM MgCl2, 0,1 mM EGTA, 0,2 mM ADP, 0,3 mM Glucose, 0,1 mM DTT, pH 8.0) in einer Konzentration von 20 µM jedes Proteins, gemischt im Verhältnis 1:1 mit 2× Ladepuffer (Laufpuffer mit 20 % Glycerin, Bromphenolblau, kein ADP oder MgCl2) und dann Auftragen von 5 µl Volumen auf 50 µl Probenvertiefungen. Die Gele wurden 4 Stunden lang bei 100 V auf Eis gelagert.

Fluorometrischer Assay zum Abbau von Aktinfilamenten

Der stationäre Abbau von ADP-Actinfilamenten wurde wie folgt durchgeführt: 5% Pyren-Actin wurde in 20 mM HEPES, 100 mM NaCl, 1 mM MgCl2, 1 mM ATP, 1 mM DTT, pH 7,4 für 60 min polymerisiert. Die Widerhakenenden des Filaments wurden mit 50 nM Capping-Protein verschlossen. Anschließend wurden 0,5 µM Cofilin (und 0,5 µM N-CAP) zugegeben, und die Reaktion wurde durch Zugabe von 4 µM Vitamin-D-Bindungsprotein (Monomer-Sequestrierungsmittel) gestartet. Die Endkonzentration von Aktin betrug 2,5 µM. Der Aktinabbau wurde durch Verfolgung der Pyren-Fluoreszenz mit Anregung bei 365 nm und Emission bei 407 nm auf einem Fluoreszenzspektrophotometer (Agilent) für 2400 s bei 22 °C gemessen.

CD-Spektrometrie

Die CD-Spektren für den N-CAP-Wildtyp, die Mutanten und die HFD-Domäne wurden bei 20 °C mit dem J-720-Spektropolarimeter (Jasco) in einer 300-µl-Quarzküvette von 0,1 cm Lichtweglänge mit folgenden Parametern gemessen: kontinuierlicher Scanning-Modus mit einer Scanning-Geschwindigkeit von 50 nm/min, Bandbreite 0,5 nm, Wellenbereich 190-260 nm, Datenabstand 0,5 nm. Alle Proteine wurden mit 10 % PBS-Puffer auf 15 µM verdünnt. Die Akkumulation von zehn Scans für jedes Protein wurde als eine einzige Kurve aufgetragen.

Modelle für atomistische MD-Simulationen

Die Modelle für cofilin-verziertes Aktin basierten auf der 3,8 Å auflösenden Kryo-Elektronenmikroskopie-Struktur (PDBID: 5YU8)41. Die fehlenden Schleifen wurden mit RosettaCM59 und RosettaScripts60 unter Berücksichtigung der Elektronendichtekarte41 und der damit verbundenen Helixsymmetrie erstellt. Um mit den experimentellen Konstrukten in dieser Arbeit übereinzustimmen, wurden die Aktin- und Cofilin-Sequenzen in diesem Stadium von denen des Huhns auf die des Kaninchens bzw. der Maus geändert. Es wurden über 1000 Modelle erstellt. Anschließend wurden sie anhand ihrer Gesamtpunktzahl sortiert und diejenigen herausgefiltert, die strukturelle Artefakte (z. B. cis-Peptidbindungen) enthielten. Mit den drei Modellen mit der höchsten Punktzahl wurden Molekulardynamiksimulationen (MD) durchgeführt (ergänzende Tabelle 1, Simulationen F1-3).

Der HFD-Actin-Komplex wurde aus dem kristallisierten HFD-Domäne/Actin/Twinfilin-ADF-H-Domänen-Komplex isoliert und separat an die oben beschriebenen ausgewählten cofilin-geschmückten Actin-Filamentmodelle angedockt. Zu diesem Zweck wurde das isolierte HFD-Actin auf jedes Aktinmonomer mit spitzem Ende gelegt, das dann durch das HFD-Actin ersetzt wurde. Auf diese Weise wird die Kristallstrukturkonformation des Aktin-HFD-Dimers auf die Spitze des mit Cofilin dekorierten Aktins übertragen. Die angedockten Modelle wurden zunächst mit dem Docking-Protokoll61 lokal verfeinert, gefolgt von einer eingeschränkten Relaxation mit dem schnellen Relax62 -Protokoll, das in der Rosetta Software Suite enthalten ist. Dieser Prozess wurde für jedes Cofilin-dekorierte Aktinfilament, das für MD-Simulationen ausgewählt wurde, separat durchgeführt (ergänzende Tabelle 1, Simulationen C1-3).

Konstruktion des spitzen Endsegments für MD-Simulationen

Jede Simulation wurde an einem spitzen Endsegment des ausgewählten Cofilin-dekorierten Aktinfilamentmodells durchgeführt, das durch Schneiden des Modells senkrecht zur Achse des Filaments erstellt wurde. Die Schnittebene wurde so gewählt, dass vier ganze ADP-Mg2+-gebundene Aktinmonomere und drei ganze Cofilinmonomere in dem Segment enthalten waren (ergänzende Tabelle 1, Simulationen F1-3). Das Segment enthielt auch die beiden HFD-Domänen am spitzen Ende in den HFD-gebundenen Systemen (ergänzende Tabelle 1, Simulationen C1-3). Das Segment mit dem spitzen Ende enthielt außerdem mehrere Polypeptidfragmente von Cofilinen und Aktinen an seinem Widerhakenende (ergänzende Abb. 5a). Um ihre Konformation und Position während der Simulationen beizubehalten, wurden diese gebrochenen Ketten während der Simulationen wie folgt in ihrer Position gehalten: Eine Schicht von Resten an der Schnittstelle zum Rest des spitzen Endsegments wurde frei gelassen; alle schweren Atome in der Nähe der Schnittebene und nur die schweren Atome des Rückgrats für die Regionen dazwischen wurden mit einer Kraftkonstante von 100 kJ/mol/nm2 zurückgehalten (ergänzende Abb. 5a). Diese teilweise eingeschränkten Polypeptidfragmente am Widerhakenende dienen während der Simulationen als Plattform. Auf diese Weise bleiben sowohl die filamentartige Protein-Protein-Grenzfläche am Widerhakenende als auch die Ausrichtung des Filaments während der Simulationen erhalten.

Die Protonierungszustände der Reste wurden bei neutralem pH-Wert auf der Grundlage von pKa-Berechnungen mit PROPKA363 bestimmt. Jeder Aktin-H73-Rest wurde methyliert (Nτ-Methyl-l-Histidin, HIC), und die N-Termini von Aktin, Cofilin und HFD wurden acetyliert. Die Topologien für jedes Molekül in den Systemen wurden mit dem LeAP-Programm erstellt, das mit ambertools1864 vertrieben wird, und dann mit dem ParmEd-Tool in das GROMACS-Format konvertiert.

Jedes spitze Endstück, das aus den ausgewählten Modellen erstellt wurde, wurde in einer hexagonalen Prismen-Simulationsbox platziert, deren lange Achse mit der z-Achse ausgerichtet war. Die Abmessungen des Kastens wurden so gewählt, dass der Mindestabstand zwischen dem Filament und jeder Fläche des Kastens etwa 17 Å betrug (ergänzende Tabelle 1). Jedes System wurde mit 0,15 M NaCl-Lösung gelöst, wobei die Anzahl der Ionen so angepasst wurde, dass das System neutralisiert wurde.

Vor den Produktionsläufen wurden steilste Abstiegsminimierung und aufeinanderfolgende kurze Äquilibrierungssimulationen (insgesamt ~7 ns) in den NVT- und NpT-Ensembles unter Verwendung des Berendsen-Thermostats und des Barostats65 durchgeführt. Während dieser Äquilibrationssimulationen wurden harmonische Positionsbeschränkungen auf die spitze Endscheibe angewendet. Eine kleinere Gruppe von Atomen (alle schweren Atome, das Proteinrückgrat und schließlich nur die Cα-Atome) wurde in jeder aufeinanderfolgenden Äquilibrationssimulation mit einer Kraftkonstante von 1000 kJ/mol/nm2 eingeschränkt.

Die Systeme, die von den anderen abgezweigt wurden (ergänzende Tabelle 1; C1′, C2′. F2′) wurden durch geeignete Modifikationen (Andocken oder Entfernen von HFD-Domänen), Entfernen der überlappenden Lösungsmittelmoleküle (wenn HFD-Domänen angedockt waren) und Neuanpassung der Boxgröße und der Lösungsmittelatome an die neue Systemgröße hergestellt. Die gestufte NVT- und NpT-Equilibrierung mit Beschränkungen wurde wie oben erwähnt durchgeführt (insgesamt ~200 ps für Simulationen, bei denen HFD-Domänen entfernt wurden, und insgesamt ~4 ns, wenn sie angedockt ist).

Alle Produktionsläufe wurden für 1-2.5 μs im NpT-Ensemble durchgeführt, wobei nur die oben erwähnten Positionsbeschränkungen auf die Plattformregion angewendet wurden.

Kraftfelder und Parameter in MD-Simulationen

Die folgenden Kraftfelder und Parametersätze wurden in den MD-Simulationen verwendet: Amber ff14sb66 für die Proteine, das TIP3P-Modell67 für Wasser, der Parametersatz für monovalente Ionen von Joung und Cheatham68 für Na+ und Cl-, ein oktaedrisches Multisit-Ionenmodell von Saxena und Sept69 für Mg2+ und ein Parametersatz für polyphosphorylierte Verbindungen von Meagher et al.70 für ADP. Die fehlenden Bindungsparameter für Methyl-Histidin (Nτ-Methyl-l-Histidin, HIC) wurden aus dem GAFF2-Kraftfeld64 übernommen. Die Atomladungen wurden nach dem Protokoll von Duan et al.71 berechnet.72 Die R.E.D.III.5-Software72 wurde für die Anpassung des eingeschränkten elektrostatischen Potenzials (RESP) für mehrere Konformationen unter Verwendung einer erweiterten und einer α-helicalen Konformation des HIC-Dipeptids (Ace-HIC-Nme) verwendet. Alle quantenchemischen Berechnungen wurden mit der Programmsuite Gaussian0973 auf dem Theorieniveau b3LYP/cc-pVTZ durchgeführt. Ladungsberechnungen wurden mit dem IEFPCM-Modell in einem polarisierbaren Kontinuum mit einer Dielektrizitätskonstante von 4 durchgeführt, wobei das Lösungsmittel als Ether eingestellt wurde.

MD-Simulationsprotokolle

Alle Simulationen wurden mit GROMACS 2018 74 durchgeführt. Die Bewegungsgleichungen wurden mit einem Leap-Frog-Algorithmus mit einem Zeitschritt von 2 fs integriert. Alle Bindungen wurden mit dem LINCS-Algorithmus75 eingeschränkt. Die Simulationsprotokolle wurden gemäß Ref. 66. Elektrostatische Wechselwirkungen über große Entfernungen wurden mit dem glatten Teilchennetz des Ewald-Schemas76 mit einem Realraum-Cutoff von 0,8 nm, einem Fourier-Abstand von 0,12 nm und einer Interpolation vierter Ordnung behandelt. Für van-der-Waals-Wechselwirkungen wurde das Lennard-Jones-Potenzial mit einem Cutoff-Wert von 0,8 nm verwendet. Langreichweitige Dispersionskorrekturen wurden für Energie und Druck angewendet77.

Alle Produktionssimulationen wurden im NpT-Ensemble durchgeführt. Die spitze Endscheibe, die Plattform und das Lösungsmittel (Wasser und 0,15 M NaCl) wurden mit Hilfe des Nosé-Hoover-Thermostats78,79 mit einer Zeitkonstante von 1,0 ps an getrennte Temperaturbäder bei 310 °K gekoppelt. Für die isotrope Druckkopplung wurde der Parrinello-Rahman-Barostat80 mit einem Referenzdruck von 1 atm, einer Zeitkonstante von 5 ps und einer Kompressibilität von 4,5 × 10-5 bar-1 verwendet.

Analyse der MD-Simulationen

Alle Analysen wurden mit VMD81 und eigenen Skripten durchgeführt. Die MMGBSA-Berechnungen wurden mit der Software MMPBSA.py82 durchgeführt, die mit ambertools1864 vertrieben wird, wobei das von Onufriev et al.83 entwickelte modifizierte GB-Modell verwendet wurde. mit einer Salzkonzentration von 0,15 M (alle 100 ns wurden Frames abgetastet, wobei die ersten 500 ns jeder Simulation verworfen wurden).

Strukturanalysen

Für die Analyse der verschiedenen Aktinstrukturen und ihrer Konformationszustände, die in Abb. 1d dargestellt sind, folgten wir dem Protokoll von Tanaka et al41,84.

Statistische Analyse und Reproduzierbarkeit

Daten in den Abbildungen 2d, 4b und 4d wurden aus mehreren Experimenten, die an unterschiedlichen Tagen durchgeführt wurden, zusammengeführt und repräsentieren somit Daten aus mehreren unabhängigen Experimenten. Die Felder 2f, 2g, 2h und 3d zeigen Daten aus einem einzigen repräsentativen Experiment. n beschreibt die Anzahl der analysierten Filamente für die Felder 2d, 2f, 2g, 4b und 4d. n in Feld 6c entspricht der Anzahl der durchgeführten Experimente.

Die Experimente in den ergänzenden Abbildungen 2a-d, 3c und 6a-d wurden mindestens zweimal mit ähnlichen Ergebnissen durchgeführt. Die Experimente in 3d, das CARP-Domänen-Konkurrenz-Experiment in 6a und die Experimente unter montagefördernden Bedingungen in Abb. 7 wurden einmal durchgeführt.

Zusammenfassung der Berichterstattung

Weitere Informationen zum Forschungsdesign sind in der Nature Research Reporting Summary verfügbar, die mit diesem Artikel verlinkt ist.