ABSTRACT
血中から分離した疫学的に無関係なStreptococcus pyogenes株は、HEp2およびHaCaT細胞とより強い結合を示した。 HEp2細胞およびHaCaT細胞への接着を測定した。 侵襲的な分離株は、皮膚や咽頭からの分離株よりも、これらの細胞株に対して有意に高い接着性を示した。 S. pyogenesは，HEp2細胞よりもHaCaT細胞に高い接着性を示した． さらに，この病原体は，連鎖球菌後糸球体腎炎や急性リウマチ熱など，生命を脅かす可能性のある後遺症と関連している。 オーストラリアのノーザンテリトリー（NT）では、GASの咽頭分離率が低いにもかかわらず、先住民の間で急性リウマチ熱の発生率が非常に高い(3)。 さらに、GAS感染による膿皮症は極めて一般的であり、連鎖球菌後糸球体腎炎は多くの遠隔地のアボリジニ・コミュニティで流行している（4、7）。 侵襲性疾患に関連する菌株のリザーバーとして、無症状の咽頭保菌がしばしば報告されているが（5）、NTのアボリジニ・コミュニティのように膿痂疹が流行している集団では、主要なリザーバーは皮膚であると考えられる。 どの組織が主要な感染部位であるかにかかわらず、病原体が最初に達成しなければならないのは、宿主細胞への付着である。 S. pyogenesのゲノムには、アドヘシン（接着剤）をコードしていると考えられる遺伝子が数多く含まれている。 これらの遺伝子は高度に制御されており、個々の菌株がこれらのタンパク質をすべてコードする遺伝的可能性を持っているわけではない。 アドヘシンには、M蛋白（抗食細胞分子）、カプセル、フィブロネクチン結合蛋白などがある。 フィブロネクチン結合タンパク質には、SfbI (8, 12), PrtF2 (9, 10), Fbp54 (2), SfbII (11) など多くの種類が存在する。 個々の菌株の接着力は、その菌株が持つアドヘシン遺伝子のレパートリーとその発現レベルによって異なる可能性がある。 このことは、異なる組織部位に定着し、持続的に感染する能力の違いを反映していると思われる。 このことから、異なる組織部位から分離された菌株は、付着能力の違いを示すと考えられる。 このことを検証するために、我々は皮膚、喉、血液から分離されたGASが、それぞれヒト喉頭上皮細胞およびケラチノサイトを代表するHEp2およびHaCaT細胞株にどの程度結合するかを決定した
NTからのGAS分離株は1990年から2002年に収集されたものである。 本研究で分析した72株は，血液（n＝26），皮膚（n＝22），咽頭（n＝24）から分離された（表1）． 血液から分離された株は重症のものであり，残りの株は合併症のない感染症から分離されたものであった． これらの菌株は，既報の方法でVir typingを行った(6)． Virの型別には、高度に変化するMタンパク質の遺伝子を含むmga regulonの制限断片長多型が使用された。 疫学的に無関係な株が含まれるように、各Vir型から代表的な1株が含まれるようにした。 培養は、1%の酵母エキスを添加したTodd-Hewitt broth (Oxoid, Basingstoke, United Kingdom) を用い、37℃で一晩、軌道振盪器を用いて定常期まで培養した。 付着アッセイ用のGAS接種物を調製するために、一晩培養したものを遠心分離し、ペレットをリン酸緩衝生理食塩水（PBS；Life Technologies Gibco BRL、ニューヨーク州、ニューヨーク）で洗浄し、600nmでの光学密度が0.05になるまで無血清・無抗菌RPMI1640培地（Life Technologies）中に再懸濁させた。 これは、1ml当たり約1×107〜1.5×107個の細菌に相当する。
ヒト喉頭上皮（HEp2）細胞は、10％ウシ胎児血清（Life Technologies）、1％Fungizone（Life Technologies）、ml当たり20μgのバンコマイシンHCl（オーストラリア、シドニー、デビッドブル研究所）およびml当たり100μgのストレプトマイシン硫酸（アメリカ合衆国、セント・ルイ）補充RPMI1640培地で維持された。 ヒト成人皮膚ケラチノサイト（HaCaT細胞）は、10％熱不活性化ウシ胎児血清を添加したダルベッコ改変イーグル培地（Life Technologies）中で維持された。 付着アッセイでは、24ウェル組織培養プレート（Nunc, Roskilde, Denmark）の底にある直径12mmのガラスカバースリップに∼105個／mlの細胞を播種した。 5%CO2雰囲気下，37℃で一晩培養した後，PBS（pH 7.4）で洗浄し，500μlのGAS接種液を接種した． 37℃で2時間培養後、各ウェルに1 mlのPBSを加えてカバースリップを5回洗浄し、穏やかに混合した後、洗浄液を吸引して除去した。 非付着菌の除去後、宿主細胞および付着菌を95%メタノールで固定し、風乾した。 熱固定後、カバースリップをスライドに載せ、油浸下で観察するためにグラム染色を行った。 各実験において、いくつかのランダムフィールドの細胞を分析し、付着は細胞あたりのGAS鎖の平均数で表した。 すべてのアッセイは二重に行い、各菌株について平均結合を求めた。 すべての統計解析は、Stata Statistics/Data Analysis program version 7.0 (Stata Corporation, College Station, Tex.) を用いて行った。 8066>
GAS 株は両方の細胞型に接着し、結合の程度は株によって異なっていた（表1）。 20株について2つの時間間隔で繰り返した独立した実験の間には良好な相関があり（データは示さず）、結合の強さは再現可能であり、株特異的であることが示唆された。 全体として、GASのHaCaT細胞への結合は、HEp2細胞への結合よりも大きい（P < 0.05）。 表1のデータを分離した組織部位に基づいて分離すると、血液中のGAS株は平均270鎖が50個のHaCaT細胞に結合した(Fig. 1)。 一方、皮膚と咽頭の分離株は、50個のHaCaT細胞あたりそれぞれ平均169本と178本の鎖しか結合しなかった。 これらの差は統計的に有意であった（それぞれP = 0.0044および0.0063）。 興味深いことに、HEp2細胞では、この差はそれほど顕著ではなく、統計的に有意ではなかった。 しかし、皮膚と喉の分離株のデータを組み合わせて、侵襲性感染と非侵襲性感染に基づいてデータを再分析したところ、両細胞株で2つのカテゴリー間に有意差が認められた（P = 0.0011 for HaCaT; P = 0.0238 for HEp2）。
この研究室の以前の研究で、一般に流通しているS. pyogenes株の多くが皮膚を主要感染部位として侵襲性疾患を引き起こすことが明らかにされた（1）。 これらの知見は、NT GAS株がHEp2細胞株よりもHaCaT細胞に対して高い感受性を示し、血液分離株が合併症のない感染症からの分離株よりも多く結合できることを示した今回の結果と一致する。 S. pyogenesの高い接着傾向の説明として、侵襲性疾患由来と非侵襲性疾患由来の分離株の遺伝子型および表現型の差異が考えられる。 この結合強度の性質を明らかにし、それがクローン集団内で一貫しているかどうかを決定するために、さらなる研究が必要である。
HaCaTおよびHEp2細胞株へのGASの結合の比較。 統計的に有意な結果はアスタリスクで示されている。 エラーバーは標準誤差を示す。
- View inline
- View popup
Vir type, binding, and source of GAS isolates used in this study
ACKNOWLEDGMENTS
D. Gordon and E. Giannakisに助言とHaCaT細胞の提供を受けた。
Cooperative Research Centre for Aboriginal and Tropical Healthより資金援助が得られた。