材料と方法
参加者
対象は6歳から13歳のADHD児83人（75％男性）とTD児72人（51％男性）である。 ADHD群のインクルード基準は以下の通りであった。 (a)DSM-IV基準によるADHDの臨床診断，(b)保護者に実施したDISC-IV-P（Diagnostic Interview Schedule for Children, fourth edition）による診断の確認。 )、(c)Disruptive Behaviour Disorder Rating Scale（DBDRS；）のADHD尺度（Inattention尺度およびHyperactivity/Impulsivity尺度）の少なくとも1つで親の評価＜252＞90％により示される著しいADHD症状、(d) DBDRSのADHD尺度の少なくとも1つで教師の評価＜252＞75％により示される広汎なADHD症状、です。 併存する診断（例えばODDやASD）があることは除外基準ではなく，覚醒剤による治療も除外基準ではなかった。 覚せい剤治療を受けている子どもたち（N = 50、ADHD群の60％）は、完全なウォッシュアウトを可能にするため、試験の24時間前、および本研究への参加期間中に薬物の使用を中止している。 TDグループの参加基準は以下の通りである。 (a)いかなる発達障害または行動障害（ADHDおよびODDを含む）の臨床診断を受けていないこと、(b)DBDRSの親および教師評価ADHD尺度の両方で<90パーセンタイルのスコア。
資料
行動。
ADHDグループに含めることができた子どもの保護者はDISC-IV-Pの破壊行動障害セクションで評価を受けた。 DISC-IV-PはDSM-IVの小児精神疾患の評価に広く用いられている標準的な診断面接で，十分な心理測定特性を有している。
ADHD群とTD群の両方の子どもの親と教師は，ADHDの症状，ODDとCDの症状についてDBDRSを記入して評価した。 DBDRSは，不注意，多動性/衝動性，ODD，CDの症状を4段階のLikertスケール（0～3）で測定する4つの尺度からなり，得点が高いほど症状が悪いことを示す。 DBDRSの十分な計量心理学的特性が報告されている。
The Strengths and Weaknesses of ADHD-symptoms and Normal Behaviour rating scale (SWAN; ) は，ADHDの症状を評価するために両親と教師によって記入されたもので，ADHDの症状に対する評価である。 この広く用いられている質問紙は，不注意尺度と多動性/衝動性尺度の2つの下位尺度を持ち，それぞれ9項目から構成されている。 項目は7段階のリッカート尺度（-3から＋3まで）で採点され、得点が高いほど症状が悪化していることを示しています。 項目はDSM-IVのADHDの症状に基づいていますが、各ADHDの症状で説明される行動の両端（強と弱）を反映しています。 両下位尺度の平均点を従属変数とした。 SWANの十分な心理測定特性が報告されている。
ASD 症状は，保護者と教師が記入する65項目のSocial Responsiveness Scale（SRS;）を使用して評価された。 SRSの項目はDSM-IVのASDの症状領域に基づいており，社会的相互作用の障害，コミュニケーション障害，行動や興味の制限/定型的パターンが含まれる。 SRSは4段階のリッカート尺度（0から3まで）を使用し、SRSの合計尺度の項目得点の合計を従属尺度として使用し、得点が高いほど症状が悪いことを示す。 SRSは十分な心理測定特性を有している。
血液スポット
トリプトファン、チロシン、フェニルアラニンの血中濃度を調べるために、乾燥血液スポット法が使用された。 血液スポットの採取は静脈採血よりも小児への侵襲が少なく、乾燥血液スポット法は診断目的には十分な堅牢性と安定性を持っています。 血液中のAAA濃度は血清中のAAA濃度と高い相関がある（rsは.86から.96）． 各児童の血液スポットを使い捨ての安全ランセットを用いて採取した。 3滴の血液を血液染色カードに滴下した。 乾燥した血液スポットの5.5mmポンチをガスクロマトグラフィーバイアル（GC-vial）中の100μlの内部標準溶液（29μM L-phenylalanine-D5, 6μM L-tyrosine-D4 and 5μM L-tryptophan-D5) と400μlメタノールに混合し超音波浴中で15分振盪させた。 上澄みを別のGC-バイアルに移し、窒素雰囲気下、30℃で蒸発させた。 その後、5.5%塩化アセチル100μl（n-ブタノール中）を用いて、60℃で15分間ブチル化した。 その後、ブタノール層を窒素下で蒸発させ（30℃）、残渣を500μlのアセトニトリルに溶解させた。 トリプトファン、チロシン、フェニルアラニンの血液スポット濃度は、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）システム（パーキンエルマーシリーズ200、シェルトン、米国）に結合したAPI 3000トリプル四重極質量分析計（アプライドバイオシステムズ、フォスターシティ、カリフォルニア、米国）を用いて、ポジティブエレクトロスプレー液体クロマトグラフィー-タンデム質量分析（LC-MS／MS）により測定された。 サンプル3μlを対称型C18カラム（3.9*150mm, 5μm; Waters, Milford, MA, USA）に注入し、流速1ml/minの75%アセトニトリル（ギ酸0.4%を含有）で溶出させた。 トリプトファン、チロシン、フェニルアラニンは1分以内に溶出し、質量電荷比（m/z） 261.2→159.2 （トリプトファン）、m/z 238.2→136.2 （チロシン）、m/z 222.2→120.2 （フェニルアラニン）のトランジションで測定された。 得られたすべてのLC-MS/MSデータは、Analyst 1.4.2 software (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) を用いて取得・処理された。 トリプトファン、チロシン、フェニルアラニンの血液スポット濃度は、μmole/Lで表した。 LC-MS/MSの信頼性は、アッセイ間分散（5-10％）、アッセイ内分散（8-10％）、回収率（90-112％）を調べることで確認した。
食事によるタンパク質摂取
1日のタンパク質摂取量を3日間、親からの報告の栄養日記を使って評価した。 標準化された食事記録と説明書が提供された。 親は、食事記録に摂取したすべての食品と飲料を登録し、摂取量をできるだけ正確に表現するよう指示された。 タンパク質の摂取量（グラム/日）は、オランダの食品成分データベースをコンピュータ化したものに基づいて計算された。 オランダの食品成分データベースは、2000以上の食品とその栄養成分に関する情報を含んでいます。 4497>
尿.
尿中AAA濃度を調べるために、参加者は連続18時間以内（放課後）に排泄されたすべての尿を採尿容器に採取した。 採尿の際、容器は冷蔵庫（<5℃）で保管した。 10mlのサンプルは分析のために検査室に送られ、サンプルは-20℃で保存された。 尿中のトリプトファンの分析には、蛍光検出器付きのHPLC技術が使用された 。 尿中のチロシンとフェニルアラニンの濃度は、Biochrom アミノ酸分析器を用いて測定された。 トリプトファン、チロシン、フェニルアラニンの尿中濃度は、多尿や乏尿の影響を排除するために、全尿量に対するμmoleの比率で表示した。 HPLC技術の信頼性は、分析の精度を調べることによって確認され、トリプトファンで2.25％（相対標準偏差）、チロシンおよびフェニルアラニンで1.50％であった。 12時間試料と24時間試料のアミノ酸濃度の間には高い相関があり、アミノ酸の排泄に日内変動がないことを示し、今回の研究で18時間試料を使用したことの妥当性を示している。
手順
この研究は、オランダのVU大学医療センターアムステルダムの地元の医療倫理委員会から承認を受け（#NL39922.029.12）、1964年のヘルシンキ宣言とその後の改正で定められた倫理基準に従って実施されている。 参加に先立ち、全児童の保護者、および12歳以上の児童から書面によるインフォームドコンセントを取得した。 ADHDの子どもは、精神科の外来診療所、行動問題を抱える子どもの親の会、および大学の研究サイトを通じて募集した。 TDグループは、全国にある小学校から募集された。 覚醒剤を服用している児童は、完全なウォッシュアウトを確保するため、参加前日（0日目）および血液、尿、食物摂取量の評価中（1日目から3日目）に薬物の使用を中止させた。 1日目は、血中AAA濃度の日内変動による影響を排除するため、早朝に血液スポットを採取した。 同日、放課後に採尿を開始し、翌朝、子供が学校に戻るまでの18時間、採尿を続けた（2日目）。 1日目の早朝、保護者に食事記録の記入方法と子どもの採尿方法について詳しい説明があった。 その後、保護者は子どもの食事記録を開始し、その後3日間（1日目〜3日目）、食事記録を続けた。 保護者と教師には、セキュリティで保護されたウェブサイト上でアンケートに回答するよう呼びかけました。 すべてのデータは、2013年2月から2014年7月の間に収集されました。 ADHD群とTD群は同時に募集し、食物摂取やAAA代謝に考えられる季節の影響をコントロールした。
データ解析
すべての統計解析はR、バージョン3.2.1を用いて実施された。 すべての変数について、ADHD群とTD群に分けて外れ値や欠損値について検査した。 外れ値にはWinsorisingが適用され、これらはグループの分布における以前の最も極端なスコアより1単位大きい（または小さい）値で置き換えられた。 尿中濃度、食事データ、行動データの欠測は、ランダムに分布し、グループの平均値を用いて置換された。 血液スポットについては、欠損データはなかった。 CD の症状を除き、すべてのデータは正規分布であった。 性別の群間差はカイ二乗検定を用い、年齢と行動機能の群間差は独立標本t検定を用いた。
第一仮説を検証するため、群（ADHDまたはTD）を固定因子とした分散分析（ANOVA）を用いてAAA血痕濃度における群間差を評価した。 効果量は部分エタ二乗で算出し、小（>.01）、中（>.06）、大（>.14）と解釈した。 さらに、オッズ比を算出し、AAA濃度が平均以下の場合にADHDと診断されるリスクを表現した。 AAA濃度の標準データは、6歳から13歳の子供（N = 104、男性52％）の大規模サンプルから得た（未発表データ、サンプル情報および結果は著者に問い合わせる）。 各AAAについて、規範サンプルの最低16パーセンタイル（M-1 SD）に相当する濃度を閾値として、平均以下のAAA濃度を定義した（トリプトファン45μmole/L、チロシン39μmole/L、フェニルアラニン47μmole/L）。 オッズ比は95％信頼区間とともに算出し、フィッシャーの正確性検定を行ってオッズ比の有意性を調べた。
第2の仮説を検証するために、ピアソン積率相関係数を用いて、血痕AAA濃度と親および教師によるADHDの症状評価との関係を調査した。 相関係数の大きさは、小（>.10）、中（>.30）、大（>.50）と解釈された。 ADHD群とTD群のデータは、ADHD症状測定のばらつきを最大化するために統合された。
第3の仮説を検証するために、全標本で血中AAA濃度とタンパク質摂取量および尿中AAA濃度の相関分析を行った。 また，グループ（ADHDまたはTD）を固定因子としたANOVAを用いて，タンパク質の摂取量と尿中AAA濃度にグループ差があるかどうかを検討した。 最後に、相関分析により、血中AAA濃度が、親や教師が報告する併存精神疾患の症状と関連しているかどうかを検討した（ODDとASDはPearson積率相関係数、CDはSpearman順位相関係数）。 ODD、CD、ASDの症状がAAA濃度と関連していることが判明した場合、これらの症状を共変数として入力し、以前の分析を再実行した。 多重検定を補正するために、相関分析のアルファレベルは、ADHDの症状（12回の分析、したがってp=0.004）、血液スポットにおけるAAA異常の潜在的決定因子（12回の分析、したがってp=0.004）、共存する精神疾患の症状（18回の分析、したがってp=0.003）であり、結果領域ごとにボンフェローニ法に従って調整された。 ボンフェローニで調整した結果を報告する＜4497＞。