Mechanism of synergistic actin filament pointed end depolymerization by cyclase-associated protein and cofilin

DNA constructs

All mouse N-CAP proteins, N-CAP-GFP.All mouse N-CAP-Actin filament-edge demolymerization by cyclase-associated protein and cofilin.N-caps-edge-dopulmerization, 完全長CAP1、HFDドメイン、HFDドメインのGST融合、ツインフィリンのC末端ADF-Hドメインは、pSUMOck4細菌発現ベクター（Inari Kursula, University of Bergen, Norwayからの親切な贈り物）にクローニングし、SENP2タンパク質分解酵素による切断後にネイティブのN末端を残すSUMOタグ融合タンパク質を発現するようにした。 CARPドメインとC-CAPのコンストラクトには、pCoofy18細菌発現ベクター（Addgene社からの親切な贈り物）を使用した。 タンパク質コンストラクトおよびコンストラクトのクローニングに用いたプライマーの詳細は、補足表2を参照のこと。

発現および精製CAPタンパク質およびその断片

完全長CAP1を除くすべてのマウスCAPタンパク質およびその断片は、LB自己誘導培地（AIMLB0210、Formedium）中で+22℃、24時間BL21（DE3） E…. coli（Novagen社製）.

完全長マウスCAP1をArcticExpress（DE3） E. coli細胞を用いてLB培地中で発現させた。 まず、カナマイシン（20μg/ml）とゲンタマイシン（20μg/ml）を含むスターター培養液を接種し、+37℃で6時間インキュベートした。 カナマイシン（20 µg/ml）のみを含む3.6 lの主培養液を接種し、240 rpmで振盪しながら+37℃でOD600が～0.4となるように培養した。 培養温度は、0.26 mM IPTGを46時間添加することで誘導されるタンパク質発現の前に1時間+13℃に変更した。すべての細菌ペレットを遠心分離で集め、50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 25 mM imidazole, pH 7.5 に再懸濁し、液体窒素とともにスナップフロックし-80℃にて保存した。 まず、リゾチーム (0.5 mg/ml), DNAse (0.1 mg/ml) およびプロテアーゼ阻害剤 (200 μg/ml PMSF, 1 μg/ml Leupeptin, 1 μg/ml Aprotin, 1 μg/ml Pepstatin A; all from Sigma-Aldrich) 存在下で菌を超音波で溶かし、溶解液を遠心分離により清澄化させた。 上清を1 ml HisTrap HP Ni-NTA カラム（GE Healthcare）にロードし、50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 25 mM imidazole, pH 7.5 で広範囲に（>20 カラム容量）洗浄した。 AKTA Pure machine (GE Healthcare) で25-250 mM イミダゾールグラジエントによりタンパク質を溶出した。 ピーク画分をプールし、SENP2プロテアーゼを最終濃度40 µg/mlで添加し、SUMOタグを除去した。 混合物を1 lの20 mM HEPES, 300 mM NaCl, 2 mM DTT, pH 7.4 バッファー中、SnakeSkin 透析チューブを用いて4℃でO/N透析を行った。 翌日、SUMO-tagと切断されたタンパク質が同じ大きさの場合、Ni-NTAアガロースビーズ（Qiagen）を用いて切断されたSUMO-tagを除去した。 タンパク質をAmicon Ultra-4 10 kDa遠心フィルター（Merck）で濃縮し、5 mM HEPES, 100 mM NaCl, 1 mM DTT, pH 7.4 で平衡化した HiLoad 16/600 Superdex 200 gel filtration column (GE Healthcare) に充填した。 ピーク画分を集め、濃縮し、N2中で凍結して-80℃保存した。

全長CAPは、以下の例外を除いて精製した。 1mlカラムの代わりに5mlのHisTrap HP Ni-NTA カラムを使用した。 HiLoad 16/60 Superdex 200ゲルろ過カラムで透析・ゲルろ過後、主要ピーク分画をSuperose 6 increase 10/300 GLゲルろ過カラムに通して、オリゴマー状態の混合物の分離をより良好にした。 最後に、数回分の主要ピークを合わせ、Amicon Ultra-4 30 kDa遠心フィルターを用いて5分間のスピン間隔で濃縮し、上記と同様に保存した。 CARPおよびC-CAPタンパク質は、タグ切断のために3Cプロテアーゼ(0.01 mg/ml)を使用することを除いて、上記のように精製された。 16. ADP-アクチンは、文献16に記載されているように調製した。 34. 簡単に言うと、0.3mMグルコースおよび1単位/mlのヘキソキナーゼ（Sigma）を含む30μM ATP-G-アクチン溶液を、ヌクレオチド交換緩衝液（5mM Tris-HCl, 0.1 mM MgCl2, 0.05 mM EGTA, 0.2 mM ADP, 1 mM DTT, pH 8.0) に対して4℃、4時間透析させた。 すべての実験はウサギ筋肉α-actinを用いて行った。

Actin pointed end depolymerization assays

アクチンフィラメント尖端解重合率の測定は、記載16のように顕微鏡装置と対になったマイクロ流体デバイスを用いて実施した。 つまり、ポリジメチルシロキサン（PDMS、Sylgard）を用いたチャンバーを用意し、それを洗浄したカバースリップに取り付けた。 マイクロ流体チャンバーは高さ20μmであった。 3つの入口と出口は、異なる生化学的組成の溶液を満たした圧力制御チューブに接続した（Fluigent microfluidics device）。

マウント後、チャンバーはdH20とFバッファ（5 mM HEPES pH 7.4, 100 mM KCl, 1 mM MgCl2, 0.2 mM EGTA, 0.4 mM CaCl2, 0.2 mM ATP, 10 mM DTTおよび1 mM DABCO）でリンスされた。 その後、チャンバーを順次曝した。 150 µl の 0.1% ビオチン-BSA in F-buffer; 300 µl の 5% BSA; 150 µl の 3 µg/ml neutravidin in F-buffer; 10-100 µl の 1-3 pM ビオチン-ゲルゾリンに暴露した。 実験の前に、アクチンフィラメントをF-buffer中で重合させた（8 µM、>30 min）。 アクチン単量体の一部をAlexa-488または568で標識した。

コフィリンで装飾された尖端部の解重合速度を測定するために、まずフィラメントを2μMコフィリンで飽和させ、異なるCAPタンパク質を添加した2μMコフィリンに曝露した。 解重合速度はImageJで解析し、まず各フィラメントのキモグラフを作成し（関数reslice）、尖端部に沿って手動で勾配をフィッティングした。 尖端が明確に追跡できないフィラメントや、観察されない休止時間53や切断事象の可能性があるフィラメントは、解析から切り捨てた。 また、N-CAP活性については標識率の影響は観察されなかった。

アクチンフィラメントの再アニーリング

再アニーリングを定量するために、異なる蛍光標識の付いた定常状態のF-アクチン溶液（Fバッファー中）を混合してインキュベートした。 混合溶液には4μMのAlexa568-actin（10%標識）と4μMのAlexa488-actin（10%標識）、N-CAPと変異体を含むか含まないかした。 室温で4分後、混合したF-actin溶液を0.2%メチルセルロース添加バッファで100倍に希釈し、両面テープでカバーリップを挟んだオープンチャンバーに流し、BSAでパッシベートした。 少なくとも3つの異なる視野で画像シリーズ（2秒間隔）を取得した。 緑色（Alexa488）のF-アクチン セグメントの数と、赤色（Alexa568）のF-アクチン セグメントに接続しているセグメントの数を数え、図 2f にプロットした 2 色セグメントの比率を決定した。 フィラメントの拡散をモニターすることで、2つのセグメントが接続されたときに、明確に判断することができた。 コントロール（F-actin mixにN-CAPを含まない）は数回、実験（N-CAPまたは変異体を含む）は少なくとも2回繰り返された。

アクチン切断アッセイ

コフィリンによる切断に対するN-CAPの影響を調べるために、（1）まだ切断に至っていない単一のコフィリンドメインの割合を測定することによって、または（2）アクチンフィラメントのμmあたりの切断イベントのグローバル数を定量化することによって、2種類の方法を用いた。

（1）単一のコフィリンドメインと関連して切断（補足図3c）。 我々は以前に記載した手順に従った16。 簡単に説明すると、マイクロ流体チャンバー内で、12% Alexa-488 標識アクチンフィラメントをスペクトリン-アクチン種から重合し、BSA-活性化カバースリップに非特異的に固定させた。 フィラメントを臨界濃度のG-actin溶液（100 nM G-actin）で15分間エージングし、フィラメントが>99%ADP46となるようにした。 その後、フィラメントを500nM mCherry-cofilin-1単独、2μM完全長CAP1、または10μM N-CAPに連続的に曝した。 ImageJで、フィラメントのキモグラフを作成し、単一のコフィリンドメインの核形成と集合、およびむき出しのアクチンセグメントとの界面での切断事象を追跡した

それぞれのドメインについて、時間0はそれらが核形成したフレームで定義した。 その上で、切断事象を誘発した時点、あるいは他のドメインによる切断、合体、打ち切り事象によって失われた時点のいずれかを記録した。 その後、古典的なKaplan-Meier法を用いて、切断事象を誘発しなかったドメインの割合を算出した

(2) Total number of severing events/µm (Supplementary Fig. 3d). フローチャンバー内（両面テープで間隔をあけた2枚のカバースリップの間）に、まずプレポリマー化したAlexa-488標識フィラメント（F-buffer中、0.2-0.3% Methylcellulose含有）を注入した。 次に、この溶液を500 nMの非標識コフィリン-1および0、1または10 µMのNCAPと交換した。 交換後、表面付近に残ったフィラメントを以下のように分析した。

1μmあたりの切断イベント数は、累積関数

ここで、Nsev(u)は時刻uにおける切断事象の数、 \({l_{i(u)}}) は時刻uにおける全フィラメントiに対する長さの総和を表す。

Binding of N-CAP to filaments pointed ends

実験は、ビオチン-PLL-PEGで活性化し、ニュートラビジンで機能化したフローチャンバー（アクチン切断測定（2）参照）内で行った。 F-actin（10%Alexa-568、1%ビオチン）は4μMで一晩重合させた。 チャンバーに注入する直前に、F-アクチンを200 nMに希釈し、0.2%メチルセルロース添加F-バッファー中で100 nM N-CAP-GFP, 2 μM cofilin-1, および4 nM キャッピングタンパク質と混合した。 アクチンフィラメントの画像は、GFPチャンネルのストリーム取得の前後に取得した（12秒間に5フレーム／秒、TIRF顕微鏡）。 フィラメント末端への結合を解析するために、ストリーム取得中に動かなかったアクチンフィラメントを盲検的に選択した。 各フィラメントの両端、3×3ピクセルの領域で蛍光を測定した。 蛍光が任意の閾値（すべてのフィラメントとフィラメント端で同じ値）を超えたとき、結合イベントが検出された。 キャッピングタンパク質は有刺鉄線を保護するはずなので、結合イベントが最も多かったのは尖った端であると考えられる。 N-CAP-GFPはフィラメント尖端部において17%のデータポイントで検出されたが、フィラメント有端部近傍でのN-CAP-GFPの非特異的結合は1.7%のデータポイントに検出された。

結晶化と構造決定

マウスHFDドメインは10×His-tagを導入して結晶化し、5 mM HEPES, 50 mM NaCl, 0.2 mM DTT, 0.01% NaN3, pH 7.5 bufferをゲルろ過で用いた以外は上記のように精製した。 サンプルは結晶化前に7-10 mg/mlに濃縮し、0.1 M カコジル酸ナトリウム、12% PEG4000 (w/v), pH 6.1 と1対1で混合し、96ウェルフォーマットに200 nlのドロップサイズでシッティングドロップ法を用いて滴下した。 2週間培養したところ、大きな針状結晶が観察された。 Diamond Light Source (UK, Didgot) のビームラインI03での遠隔データ収集のため、結晶は25%グリセロールを含む母液に浸して低温保護し、N2中でスナップ冷凍してビームラインに輸送された。 データは、波長0.9763 Å、Pilatus3 6M検出器、透過率30%、露出0.05秒、振動角0.1°で、100 Kで2400フレーム収集された。 回折データはX線検出器ソフトウェア(XDS)54で統合、スケーリングされた。 PHASER55を用い、PDB = 1s0pを検索モデルとして分子置換を行い、初期解を得た。 4つのHFDドメインが非対称ユニットに存在する解が見つかり、その後BUSTER56による複数回の精密化とCOOT57での手動構築により、データへの良好な適合が得られました（表1参照）。 並進-解放-スクリューパラメーター(1/chain)の導入、非結晶学的拘束の除去、個々の原子のBファクターモデリングによってデータを精密化することにより、さらなる改善が得られました。 4866>

三者複合体（ADP-actin、マウスCAP1のHFDドメイン、マウスtwinfilin-1のC末端ADF-Hドメイン）の結晶化では、ADP-actinを5mM HEPES, 0.5mM HEPES, +4℃でO/Nダイアリシスで準備した。2 mM MgCl2, 0.2 mM ADP, 0.2 mM EGTA, 0.3 mM グルコース, 0.5 mM β-mercaptoethanol, pH 8.0. 0.3 mM グルコースと 5 U/ml のヘキソキナーゼを含むアクチン溶液を Slide-A-Lyser 透析膜に移し、+4 ℃のフローター装置に載せた。 翌日、複合体形成前にアクチンをTLA-120ローターで355,040×gで20分間遠心分離した。 タンパク質は1:1.1:1.1の割合で混合し（アクチン、HFDドメイン、ADF-Hドメイン）、10-20 mg/mlに濃縮し、上記と同様に結晶化に使用された。 いくつかの異なる条件からヒットが得られ、0.1 M HEPES, 0.1 mM KCl, 10% PEG4000 (w/v), pH 7.0 で1：1混合した複合体の〜10 mg/ml濃度で200 nlの座液サイズで最高の回折結晶を得ることができた。 初日、数個の小さな菱形の結晶が滴下された。 3日目には大きな棒状の結晶が現れ、小さな結晶はすべて溶けてしまった。 Diamond Light Source (UK, Didgot) のビームラインI03での遠隔データ収集のため、結晶はLV CryoOil (MiTeGen) に浸して低温保護した後、N2中でスナップ冷凍して輸送された。 データは、波長0.9762Å、Pilatus3 6M検出器、透過率20%、露出0.05秒、振動角0.15°で100Kで合計2400フレームとして収集された。 回折データはXDS54で積分、スケーリングされた。 PHASER55とPDB = 3dawを検索モデルとして分子置換を行い、初期解を得たところ、アクチン単量体の尖端部に明確な余剰密度があることが分かった。 そこで、再度分子置換を行い、3dawと1s0pを探索モデルとして、BALBES58を用いて三者複合体の初期モデルを得ることができた。 その結果、Q = 0.787、Rwork/Rfree = 29.7%/35.6% という解が得られました。 この非対称ユニットには、HFD:ADF-H:ADP-actinの1:1:1複合体が1つ含まれていた。 BUSTER56による複数回の精密化とCOOT57による手動での構築、特にD-loopとHFDドメインのα-helicesの連結ループの再構築が、モデルの改良に必要であった。 最終的には、水の追加、並進-ライブラリースクリューのパラメータ（1/chain）の導入、個々の原子のB-factorのモデル化により、Rwork/Rfreeが16.6%/19.4%となり、全体の形状が良好なモデルが得られた。 34. 全てのゲル濾過実験は、5mM HEPES, 100mM NaCl, 0.1mM ADP, 0.1mM MgCl2, 1mM DTT, pH 7.4 で平衡化した Superdex 200 increase 10/300 GL gel filtration column で 0.5ml/min run speed と 0.5ml fractionation で +4℃で実施された。 18 μM ADF-H domain of twinfilin, 15 μM other proteinsを含む複合体100μLをカラムに注入し、溶出量を分析した。 また、ピーク画分をSDS-PAGEで分析した。 アクチン単量体競合実験は、15μMのC-CAPまたはCARPドメインをサンプルに含ませて、上記と同様に行った。 ピーク画分をSDS-PAGEで解析し、ゲルはChemiDoc XRS + imaging system (Bio-Rad) で画像化し、Image Lab (Bio-Rad) で定量化した。

Native-PAGE

Mini-Protean TGX 10% gels (Bio-Rad) を冷却したランニングバッファ (25 mM Tris, 195 mM glycine, 0.5 mM ADP, 0.1 mM MgCl2, pH 8.5) で1時間プレランしてからロードした。 サンプルは、ADP-actin透析バッファ（5 mM HEPESまたはTris、0.1 mM MgCl2、0.1 mM EGTA、0.2 mM ADP、0.3 mM グルコース、0.1 mM DTT、pH8.0）を各タンパク質20 µM濃度で混合し、2×ローディングバッファー（20%グリセロール、ブロモフェノールブルー含有、ADP、MgCl2不含のランニングバッファー）と1：1の割合で混合し、5 µl量を50 µlサンプルウェルへアプライした。 ゲルは100V、氷上で4時間行った。

Fluorometric actin filament disassembly assay

ADP-actin filamentsの定常分解を以下のように行った。 5%ピレンアクチンを20 mM HEPES, 100 mM NaCl, 1 mM MgCl2, 1 mM ATP, 1 mM DTT, pH 7.4で60分間重合させた。 フィラメントの有刺鉄線端は50 nMのキャッピングタンパク質でキャップされた。 その後、0.5 μM コフィリン（および0.5 μM N-CAP）を加え、4 μM ビタミンD結合タンパク質（モノマー封鎖剤）を加えて反応を開始させた。 アクチンの最終濃度は2.5 µMであった。 アクチンの分解は、蛍光分光光度計（Agilent）で365 nmで励起、407 nmで発光するピレン蛍光を22℃で2400秒間追跡することにより測定した。

CDスペクトル測定

N-CAP野生型、変異体、HFDドメインのCDスペクトルは、J-720分光偏光計（Jasco）を用い、0.1cm光路長の300μl石英キュベットで、以下のパラメータで20℃にて測定した：走査速度50nm/minの継続走査モード、バンド幅0.5nm、波長範囲190-260nm、データピッチ0.5nm。 すべてのタンパク質は10%PBSバッファーで15 µMに希釈した。

原子論的MDシミュレーションのためのモデル

コフィリン装飾アクチンのモデルは、3.8 Å分解能の低温電子顕微鏡構造（PDBID: 5YU8）41 に基づいています。 欠損ループはRosettaCM59とRosettaScripts60を用いて、電子密度マップ41の存在下で、関連するらせん対称性を付与して構築した。 この研究の実験構成に合わせるために、アクチンとコフィリンの配列は、この段階で、それぞれニワトリのものからウサギとマウスのものに変更された。 1000以上のモデルが作成された。 これらのモデルは、合計スコアに基づいてソートされ、構造的アーチファクト（例えば、シス型ペプチド結合）を含むものがフィルタリングされた。 分子動力学（MD）シミュレーションは、トップスコア3モデルから開始された（補足表1、シミュレーションF1-3）。

HFD-アクチン複合体は、結晶化したHFDドメイン／アクチン／ツインフィリンADF-Hドメイン複合体から分離し、上記の選択したコフィリン装飾アクチンフィラメントモデルに別々にドッキングさせた。 この目的のために、単離されたHFD-アクチンは、それぞれの尖端アクチン単量体に重ね合わされた。 このようにして、アクチン-HFD二量体の結晶構造コンフォメーションは、コフィリンで装飾されたアクチンの先端に移される。 ドッキングされたモデルは、まずドッキングプロトコル61を用いて局所的に改良し、次にRosetta Software Suiteで配布されているfast relax62プロトコルを用いて拘束緩和を行った。 このプロセスは、MDシミュレーションのために選択した各コフィリン装飾アクチンフィラメントについて別々に適用した（補足表1、シミュレーションC1-3）。

MDシミュレーション用の尖端セグメントの構築

各シミュレーションは、フィラメントの軸に対して垂直にモデルを切断することによって作成した、選択したコフィリン装飾アクチンフィラメントモデルの尖端セグメントに対して行った。 スライスの平面は、4つのADP-Mg2+結合アクチンモノマー全体と、3つのコフィリンモノマー全体がセグメント内に含まれるように選択した（補足表1、シミュレーションF1-3）。 このセグメントには、HFD結合系では尖端部にある2つのHFDドメインも含まれていた（補足表1、シミュレーションC1-3）。 また、尖端側のセグメントには、コフィリンやアクチンからのポリペプチド断片が棒状端にいくつか含まれていた（補足図5a）。 シミュレーションの間、そのコンフォメーションと位置を維持するために、これらの壊れた鎖は、以下のようにシミュレーションの間、位置的に拘束されたままであった。 尖端セグメントの残りの部分との界面にある残基の層は自由にしておき、切断面付近のすべての重原子とその間の領域の骨格重原子のみを100 kJ/mol/nm2 の力定数で拘束した（補足図5a）。 これらの部分的に拘束された棒状端のポリペプチド断片は、シミュレーションの際にプラットフォームとして機能する。 4866>

残基のプロトン化状態は、PROPKA363を用いたpKa計算により中性pHで決定された。 アクチンのH73残基はメチル化（Nτ-Methyl-l-histidine, HIC）され、アクチン、コフィリン、HFDのN末端はアセチル化されていた。 4866>

選択したモデルから作成した各先端スライスを、長軸をz軸に合わせた六角柱のシミュレーションボックス内に配置した。 ボックスの寸法はフィラメントとボックスの各面との間の距離が約17Åになるように選んだ（補足表1）。

製造前に、ベレンゼンサーモスタットとバロスタット65を用いて、NVTとNpTアンサンブルで最急降下最小化と連続した短い平衡化シミュレーション(合計7ナノ秒)が行われた。 これらの平衡化シミュレーションの間、尖った端のスライスに調和的な位置拘束が適用された。 より小さな原子群（すべての重原子、タンパク質骨格、最終的にはCα原子のみ）は、連続した各平衡化シミュレーションにおいて、1000kJ/mol/nm2の力定数で拘束された

他から分岐した系（補足表1；C1、C2、． F2′）は、適切な修正（HFDドメインのドッキングまたは除去）を行い、（HFDドメインがドッキングされている場合）重なり合う溶媒分子を除去し、新しいシステムサイズに合わせてボックスサイズと溶媒原子を再調整して調製された。 拘束を伴う段階的なNVTおよびNpT平衡化は、上記のように行われました（HFDドメインが除去されたシミュレーションでは合計〜200ps、ドッキングされた場合は合計〜4ns）

すべての生産ランは、1-2について実行されました。5 μs、NpTアンサンブルで、プラットフォーム領域の前述の位置拘束のみで実施。

MDシミュレーションにおける力場とパラメータ

MDシミュレーションでは、以下の力場とパラメータセットを使用した。 タンパク質にはAmber ff14sb66、水にはTIP3Pモデル67、Na+とCl-にはJoung and Cheatham68による一価イオンパラメータセット、Mg2+にはSaxena and Sept69による八面体マルチサイトイオンモデル、ADPにはMeagherらによるポリリン酸化化合物パラメータセット70を使用しました。 メチルヒスチジン（Nτ-Methyl-l-histidine, HIC）の欠損結合パラメータは、GAFF2力場64から採用した。 HIC ジペプチド（Ace-HIC-Nme）の拡張型およびα-らせん型コンフォーメーションを用いた多形拘束静電ポテンシャル（RESP）フィッティングには R.E.D.III.5 ソフトウェア72 を使用した． すべての量子化学計算は，Gaussian09 program suite73を用い，b3LYP/cc-PVTZレベルの理論で行った． 電荷計算は、溶媒をエーテルとすることにより、誘電率4の分極性連続体においてIEFPCMモデルで行った。

MD simulation protocols

すべてのシミュレーションはGROMACS 2018 74を用いて実施した。 運動方程式は、2fsの時間ステップでリープフロッグアルゴリズムを使用して積分された。 すべての結合は、LINCSアルゴリズム75を使用して制約された。 シミュレーションプロトコルは、ref. 66. 長距離静電相互作用は、実空間カットオフ 0.8 nm、フーリエ間隔 0.12 nm、4 次補間による平滑粒子メッシュ Ewald スキーム76 で扱った。 ファンデルワールス相互作用には、 0.8 nm のカットオフを持つ Lennard-Jones ポテンシャルを使用した。 エネルギーと圧力には長距離分散補正をかけた77。

すべての生成シミュレーションはNpTアンサンブルで行った。 この時、 先端スライス、 プラットフォーム、 溶媒(水と 0.15 M NaCl)は、 Nosé-Hoover サーモスタット78,79 を用いて 310°K の別々の温度浴に 1.0 ps の時定数で結合された。 等方圧力結合はParrinello-Rahman barostat80を用い、基準圧力1 atm、時定数5 ps、圧縮率4.5 × 10-5 bar-1で行った。

Analysis of the MD simulations

すべての解析にはVMD81と社内スクリプトを用いている。 MMGBSA計算はambertools1864で配布されているMMPBSA.pyソフトウェア82を使用し、Onufrievら83によって開発された修正GBモデルを用いて実施した。 を用い、塩濃度0.15Mで計算した（フレームは100nsごとにサンプリングし、最初の500nsは破棄した）。 4866>

統計解析と再現性

図2d、4b、4dのデータは、異なる日に行われたいくつかの実験からプールされ、したがって、いくつかの独立した実験からのデータを表していた。 パネル2f、2g、2hおよび3dは、単一の代表的な実験から分析されたデータを示す。nは、パネル2d、2f、2g、4bおよび4dについて分析したフィラメントの数を表す。パネル6cのnは、実験を実施した回数に相当する。 3dの実験、6aのCARPドメイン競合実験、図7の集合促進条件での実験は1回実施した。

報告概要

研究デザインに関するさらなる情報は、この論文にリンクしたNature Research Reporting Summaryに掲載されている。