Generation of RyR1Flox/Flox::HSA-Cre-ERT2 マウスモデル
RYR1遺伝子のエクソン9-11の両側にloxPサイトを挿入したマウス（いわゆるRyR1Flox/Flox）とヒト骨格筋αアクチン遺伝子制御下でタモキシフェン依存性Cre-ERT2リコンビナーゼを発現するマウス株HSA-Cre-ET2を掛け合わせて、RyR1Flox/Flox::HSA-Cre-ET2が作製された。 タモキシフェン注射により骨格筋で選択的にCre-ERT2リコンビナーゼが活性化され、エクソン9-11が欠失し、骨格筋のRYR1遺伝子がタモキシフェンに厳密に依存した状態で破壊されます（図1a）。 出生時、RyR1Flox/Flox::HSA-Cre-ERT2マウスは正常であり、2ヶ月齢の若齢成体になると、タモキシフェン注射により組み換えが誘導された（この時点から、組み換え動物をRyR1-Recと呼ぶことにした）。 分子的および生理学的な結果は、組換え誘導後105日までの時間の関数としてさらに研究された(Fig. 1b)。 対照動物（CTRL）は、タモキシフェンを注射した同腹のRyR1Flox/Flox（HSA-Cre-ERT2導入遺伝子を含まない）である。 75日目の組換えマウスの全体的な表現型は、後肢の異常な運動性とよちよち歩きを伴う後彎によって特徴づけられる。 餌を食べるために後足で立つことはできるが、病気の進行とともに餌のペレットが計画的にケージ内で直接与えられるようになっていた。 105日目でもケージ内での移動は可能であり、CTRLと比較して死亡率の増加は観察されなかった。 オス、メスともに発症した。 CTRLとRyR1-Rec動物において、組換え後15日ごとに大腿四頭筋のmRNAレベルの相対量をRT-q-PCRで解析した（図1c）。 RyR1 mRNAの急速な低下が観察され、タモキシフェン注入後3日目には早くも初期値の21%±4%の低値で安定したレベルに到達した。 組換え誘導後75日目には、試験した全ての筋肉で減少が見られた（大腿四頭筋、前脛骨筋、EDL、ヒラメ筋、追記1：図S1A）。 さらに、大腿四頭筋ホモジネートの定量的ウェスタンブロットを用いて、RyR1タンパク質の量を分析した（図1d、e）。 この量は徐々に減少し、105日後に初期値の約50%に達した。 それ以上の日数では、RyR1タンパク質のそれ以上の減少は観察されなかった（データは示さず）。 組換えから75日後の異なる筋ホモジネートにおいて、RyR1タンパク質の量を定量した。 全てのアッセイした筋肉で減少が観察されたが、残存量は筋肉間でわずかに異なり、最も高いのは骨間筋（64％±5％）、最も低いのはヒラメ筋（33％±5％）だった（追加ファイル1：図S1B）
RyR1Flox/Flox::HSA-Cre-ERT2 mouse modelにおいてタモキシフェン注入後に減少したRyR1のmRNAとタンパク質。 a RyR1 WT alleleのエクソン9-11両側にLoxP部位を挿入してRyR1-flox alleleを作成した。 組換え後、RyR1-Rec alleleはエクソン9-11が欠失する。 パネルケアのRyR1転写物のRT-q-PCR増幅に使用したプライマーは、エクソン103と104にそれぞれ赤い矢印で表した。 b 生後2ヶ月（D0）に組換えを誘発するためにタモキシフェンを注射し、その後の時期を変えて解析した。 c 各時点でn = 3-6 の異なるマウスの大腿四頭筋において、参照遺伝子としてのβ-アクチン、HPRT、GAPDHと比較したmRNAの相対量をRT-q-PCRで評価し、各時間の平均±SEMとして示した。 CTRL littermate での量を 1 とし、定量は△△Ct 法で行った。 統計解析。 d 各時点で n = 3-6 の異なるマウスの大腿四頭筋ホモジネートにおいて、ミオシン重鎖と比較した RyR1 の相対量を定量的ウェスタンブロットにより評価した。 e 各時点におけるCTRLおよびRyR1-Rec大腿四頭筋ホモジネートのRyR1の代表的なウェスタンブロットで、ミオシン重鎖をタンパク質量のコントロールとして使用したものである。 統計解析。 One way ANOVA with Holm-Sidack’s test for multiple comparisons
RyR1-Rec mice shows progressive reduction in muscle and body weight and in muscle strength
RyR1減少の結果をまず全動物レベルで検討した。 最初は同じ体重であったが、CTRL動物はD90で24.4 ± 0.4 から30.6 ± 0.8 gと徐々に体重が増加したのに対し、RyR1-Rec動物はD90で20.6 ± 1.3 gと徐々に体重が減少した（図2a）。 雄雌ともに影響を受け、75日後には初期体重の約13％を失った（Additional file 1: Fig.） これは、全ての筋肉で体重減少が観察された結果である（Additional file 1: Fig. S1D）。 RyR1減少後の全体的な筋パフォーマンスを調べるため、動物に2種類の筋力テストを行った。 まず、4本の前足でクロスワイヤーの表面を掴んで5分間ぶら下がり、落下までの待ち時間が筋力を反映するようにさせた。 105日間、1週間ごとに握力試験を行ったところ（図2b）、RyR1-Rec動物はタモキシフェン注射後20-30日でRyR1量が初期値の75-80%程度になると筋力が低下し始め、75日後にはRyR1量が60%程度になり、グリッドにぶら下がることができなくなることが示された。 筋力は、全身麻酔下で腓腹筋の6分間の非侵襲的電気刺激プロトコルと解剖学的磁気共鳴画像法（MRI）を併用して評価された。 タモキシフェン注射から30日後のCTRL動物の電気刺激プロトコルの間（図2c、D30）、典型的な運動プロファイルが記録され、初期の筋力は安定し、筋疲労とともにゆっくりと減少した。 D60とD90のCTRL群では、運動プロファイルは動物が年をとるにつれて筋力の改善を示した（Fig. 2c）。 一方、RyR1-Rec動物では、D30ではCTRLと同様に、年齢とともにパフォーマンスが低下した。 RyR1-Rec動物はD90でもう運動を行うことができなくなった（Fig. 2c, RyR1-Rec D90）。 MR画像で測定した腓腹筋体積（図2d）は、CTRL動物ではD30（161±5mm3）からD90（164±4mm3）まで安定した値を維持した。 一方、RyR1-Recマウスでは、D30以降、腓腹筋体積はCTRLマウスよりも有意に小さくなり（141±3 mm3、p＝0.003）、さらにD60で100±3 mm3（同齢のCTRLと比較してp＜1608＞ 0.001）、D90で69 ±4 mm3（同齢のCTRLと比較してp＜1608＞ 0.001）まで減少した。 最大比筋張力（筋体積で正規化した絶対筋張力）から、D30では両群とも同程度の筋力を示したが（図2e）、RyR1-Rec動物では劇的に低下し、一方CTRL動物では年齢が上がるにつれ筋力が上昇したことが確認された。 さらに、電気刺激中の腓腹筋の生体エネルギーの変化を、D60でin vivo 31-phosphorus (31P) MR spectroscopyを用いて非侵襲的に評価した。 筋原線維内pHは両群間で差がなかったが（Additional file 1: Fig. S2A）、運動終了時のアシドーシスの程度はRyR1 Rec動物で低く（p = 0.016）、これによりこれらの動物では運動中の筋肉の解糖系フラックスが減少していることが示唆された（Additional file 1: Fig. さらに、運動後のホスホクレアチン再合成の時定数（τPCr）はRyR1-Recマウスで有意に短く（p = 0.047）、生体内のミトコンドリア機能の改善を反映していた（追加ファイル1: 図S2C, D）。 実際、運動後の回復期のPCr合成は酸化的ATP合成にのみ依存するため、τPCrは酸化的リン酸化能の指標と考えられている。 図2
RyR1-Recマウスは筋肉と体重の減少、筋力の低下が進行していることがわかる。 a 体重およびb 筋力は、動物がグリッドに逆さまにぶら下がることができる時間が5分（300秒）までのグリップテストを使用して、組み換え後の時間の関数として推定される。 データは各群10-15匹の平均±SEM、* p < 0.05 Student’s t test with Holm-Sidack’s correction for multiple comparisons。 c 2Hzで6分間の電気刺激プロトコル中に腓腹筋に生じる張力を記録。 組換え後30日（D30）、60日（D60）、90日（D90）の各時点における同一動物（CRTL、左パネル、RyR1-Rec、右パネル）の縦断的研究。 データは、CRTL動物n = 8匹およびRyR1-Rec動物n = 6匹の平均±SEMである。 d CTRL（n=8）およびRyR1-Rec（n=6）マウスの組み換え後30、60および90日の腓腹筋の体積。 データは平均値±SEMである。 統計解析：二元配置反復測定ANOVA後のポストホックLSDフィッシャー検定、*同時期のCTRLとは有意に異なる、同群のD30とは有意に異なる、同群のD60とは有意に異なる。 e 最大比筋緊張（最大筋緊張を腓腹筋体積に正規化）。 統計解析。 統計解析：二元配置反復測定ANOVAに続くポストホックLSD Fisher検定 *同時刻のCTRLと有意差あり、同群のD30と有意差あり。 また、RyR1-Recマウスでは、単離線維の生理的性質が損なわれていることがわかった。 T-チューブルネットワークは、ジ-8-aneppsで細胞膜を染色することによって画像化された。 CTRL線維とRyR1-Rec線維の間では、ネットワークの質的差異（図3a、左）も平均T管密度の量的差異も観察されなかったが、平均静止サルコメア長はわずかながら有意に短縮した（図3a、右のグラフ）。 DHPRを介した電圧活性化Ca2+流入（図3b-d）およびRyR1を介したCa2+放出フラックス（図3e-i）を同時に評価した。 CTRL線維と比較して、RyR1-Rec線維は、同様の時間経過の電圧活性化DHPR Ca2+電流を示したが（図3b）、2群のピーク電流密度対電圧（図3c）で示すように密度が減少し、電流対電圧関係の他のパラメータに関連した変化がないまま最大コンダクタンス（Gmax）の30％減少に変換された（図3d）。 SR Ca2+放出の電圧依存性は、Ca2+感受性色素rhod-2のラインスキャンイメージングから評価された。 RyR1-Rec線維のラインスキャン画像は、CTRL線維のものと定性的に似ており（図3e）、T管膜の脱分極時に蛍光が急速に上昇し、スキャンした線に沿って空間的に均一であることが示された。 振幅の増加する脱分極パルスによって誘発されるrhod-2蛍光の変化から計算されるSR Ca2+放出率（図3g）は、RyR1-Rec線維でもCTRL線維と同様の時間経過を示したが、重要なことにRyR1-Recではピーク値が減少していることが示された。 SR Ca2+放出のピーク速度対電圧のフィッティング（図3h-上）により、RyR1-Rec群ではCa2+放出の最大速度が25％減少し（図3i、Max）、傾斜係数（k）もわずかながら有意に減少したが、活性化半ばの電圧（V0.5）は変わらなかった。 RyR1-Rec線維では、SR Ca2+放出のtime-to-peak rateがわずか（平均1.3 ms）だが有意に増加した（図3h、下段グラフ）。 低親和性Ca2+感受性色素fluo-4 FFを用いて非EGTA緩衝条件下で測定した繊維の細胞質Ca2+除去能（SERCAポンプ機能）に変化は見られなかった（追加ファイル1：図中S3）。 全体として、これらの結果は、骨間部のRyR1量の35％減少が、DHPRを介したカルシウム電流の30％減少およびRyR1を介したカルシウムフラックスの25％減少に関連していることを示す。
単一分離筋線維における励起収縮結合は変化する． すべての値は平均±SEMである。 a CTRL線維とRyR1-Rec線維のジ-8-aneppsで染色したT-tubule networkの代表的共焦点画像、T-tubule密度とサルコメア長を評価できる、42 CTRL線維と41 RyR1-Rec線維（各グループ4マウス）で実施した。 b CTRL線維とRyR1-Rec線維の代表的なDHPR Ca2+電流で、0.5秒間の脱分極ステップ（10mV刻み）に反応した。 c DHPR Ca2+電流ピーク密度の電圧依存性 d CTRL線維29本とRyR1-Rec線維30本（各群5匹）の曲線cをフィットさせて得たパラメータ（参考文献 1: Supp. e -10mVへの電圧クランプ脱分極パルスで刺激したCTRL線維とRyR1-Rec線維からのrhod-2蛍光の代表的なx,t画像（a.u.） f 指定レベルへの電圧クランプパルスに応答したCTRL線維とRyR1-Rec線維からのrhod-2 Ca2+過渡変化の代表線平均値。 h SR Ca2+放出ピーク速度の電圧依存性（上）およびSR Ca2+放出ピーク速度までの時間依存性（下） i 各繊維のSR Ca2+放出ピーク速度-電圧関係をBoltzmann関数でフィットさせて得られたパラメータ（Additional file 1: Supplementary Method参照）。 データはb-d
RyR1減少が骨格筋構造に影響を与える
RyR1の減少に伴うこれらの機能変化の基礎をより理解するために、組み換え後のD75におけるRyR1-Rec動物について筋構造を調べ、CTRL動物と比較検討した。 速筋である長趾伸筋（EDL）、遅筋であるヒラメ筋、混合筋である前脛骨筋（TA）をヘマトキシリン・エオジン染色、NADH染色、ゴモリ三色染色で分析した。 図4aに示したTAの染色は、RyR1-Rec動物において筋構造の異常を示し、線維化や中心核は見られないが、繊維の萎縮が見られ、I型とII型の両方の繊維に影響があった（表2）。 同じ繊維の隣接する領域での局所的な蓄積／枯渇（矢頭および挿入図4a）およびGomori trichromeで観察される赤色染色蓄積によって特徴付けられるミトコンドリアの乱れ（Additional file 1: Fig. S4)も観察され、最近患者で報告されたダスティコアに似ていた。 繊維の萎縮はEDLでは両方の繊維タイプで観察されたが、タイプIの繊維でやや重要な減少であった（表2）。 CTRLとRyR1-RecマウスのTA横断面をRyR1とデスミンに対する抗体で染色した。 RyR1-RecのTA切片では、I型線維とII型線維の間のRyR1の分布に変化は見られず、すべての線維型において同様のRyR1の減少が見られる（図4b）。 意外なことに、デスミンの分布には重要な変化が観察され、小さなタイプIの繊維で大きく増加した（図4b）：CTRL TA切片では、すべての繊維が同様の周辺染色を示したが、RyR1-Rec TA切片の小さなタイプI繊維は繊維周辺と細胞質内の両方で大きく染色されていた（挿絵図4b）。 IF標識は定量的ではないが、これらの結果は、RyR1の減少はおそらく均一で、デスミンで観察されたような隣接する繊維間の大きな差はなく、ウェスタンブロットで行った定量化は、各繊維に含まれるタンパク質の反映であり、同じ筋肉内のRyR1が0%の繊維と100%の繊維との平均ではないことを示している。
Histological and immunofluorescent analyses shows major defects in muscles. a TA D75におけるCTRLおよびRyR1-Recマウスの横断面をヘマトキシリン・エオジン (H&E) およびNADHで染色した。 RyR1-Rec線維ではミトコンドリアの局在（NADH染色）が不均一であり、特にミトコンドリアを多く含む小さな暗色のI型（遅筋）線維に見られる（矢頭、挿入図）。 核（H&E染色の青い点）は繊維の周辺にあり、再生繊維の痕跡は見られない。 b D75 CTRLおよびRyR1-RecマウスからのTA横断切片をRyR1（緑）およびデスミン（赤）に対する抗体で染色した。 バー50μm、挿入部10μm
Triads organizationはさらに単離EDL線維の免疫蛍光標識を用いて研究した（図5a）。 RyR1-RecのEDL線維にα-アクチニン（Z線のマーカーとして）、トリアジン、RyR1（トライアドマーカーとして）を標識すると、RyR1量の減少は、トライアドの異常局在とZ線の崩壊を伴う線維の全体的な乱れをもたらしたが、トリアジンとRyR1はまだ部分的に共局在していることが示された。 Z線の両側にはトライアドが残っていたが、Z線はCTRLのように直線状にはならず、代わりに多くの微小な乱れが見られた（挿入図5a）。 D75のRyR1-Rec EDL線維について、電子顕微鏡を用いて筋の超微細構造を解析した（図5b）。 一部の領域では比較的構造が保たれていたが（図5b、左繊維）、隣接するいくつかの領域では、サルコメアの規則的な組織の崩壊、ミトコンドリアの乱れ、膜の多数のスタックの存在（図5b、矢印、挿入図で拡大）、非常に混乱していた（以前に多重トライアドと呼ばれた）。 これらのmultiple triadsの形態的特徴を正常なsingle triadsと比較して表3に示し、追加の例をAdditional file 1に示す。 図S5. T-チューブ幅、SR幅、膜間スペース（T-チューブ/SR）の正確な定量（Additional file 1: Fig. これらの結果は、RyR1-Recマウスの筋肉が膜のリモデリングに関連した一般的な構造的混乱を指摘するものである。
EDL 筋線維に一般的な構造的無秩序が認められる。 a D75 CTRL および RyR1-Rec マウスの EDL 繊維を RyR1（緑）、トリアジン（赤）およびαアクチニン（白）の抗体により染色した。 b D75 RyR1-RecマウスのEDL縦断面を電子顕微鏡で解析。 左上の繊維は正常な構造をしているが、隣接する下の繊維は極端に乱れており、膜の大きなスタック（最大15スタック、矢印）が数μmの長さで延びている。 左側はT字管に対応する膜を淡黄色で、SRシートを淡青色で着色し、見やすくした。 SRセグメント内には、隣接するT字管との接触部位に沿って電子密度の高い物質が見られるが、これはタンパク質の蓄積に対応するものである可能性がある。 表3 単一および複数のトライアドの形態学的特徴
RyR1の減少は、多くのタンパク質の量の変化に関連している
RyR1の減少の結果を、CTRLまたはRyR1-RyR2の大腿四頭筋で定量ウエスタンブロットを使って分子レベルで研究しました。Recマウス（各群8匹）は、タモキシフェン注射後D75の時点で（Fig. 6). 無染色評価で求めたタンパク質の総量を参考に、カルシウムのハンドリングに直接または間接的に関与する多数のタンパク質の相対量を推定した（図6）。 RyR1の定量は、ミオシン重鎖を基準タンパク質とした場合と差がなかった（Fig.1, 6の比較）。 トリアジンアイソフォームT95、カルシウム結合タンパク質CSQ1、Ca2+-ATPase SERCA、ミトコンドリアFoF1-ATPase、DHPRのα1サブユニットの量はCRTL筋とRyR1-Rec筋で大きな変化は見られなかった（図6a, b）。 一方、STIM1 (× 3.7 ± 1, p = 0.02), トリアジンアイソフォームT51 (× 1.6 ± 0.1, p < 0.001), CLIMP63 (× 1.8 ± 0.2, p = 0.004), ORAI1 (× 3.7 ± 1, p = 0.017) は増加が観察された。 また、構造タンパク質であるデスミンの局在の変化が免疫蛍光標識で観察されたため（図5b）、デスミン発現量も定量したところ、デスミン量の大きな増加が観察された（× 8.2 ± 1.2, p = 0.001 ）。 RyR1-RecのEDL線維におけるCLIMP63とSTIM1の局在を免疫蛍光標識で解析したところ、大きな変化は認められなかった（Additional file 1: 図S6）。 したがって、RyR1タンパク質の減少は、カルシウム調節または筋肉構造に関与する異なるタンパク質の増加と関連していた。
D75マウスの大腿四頭筋で発現したタンパク質の定量ウエスタンブロット分析は、多くのタンパク質が発現増加していることを示している。 a 2種類のCTRL（C）および2種類のRyR1-Rec（R）マウスのD75大腿四頭筋ホモジネートの各蛋白質の代表的なウェスタンブロット。 b 各グループの8種類の動物（CTRL、後ろの棒およびRyR1-Rec、青い棒）の総蛋白質量に対して正規化した各蛋白質量量の定量化。 各動物の値は、少なくとも3つのブロットの平均値である。 すべてのデータは、平均値±SEMで示される。 CTRL群の平均値は、各タンパク質について1とした。 統計解析：多重比較のためのHolm-Sidak法によるt検定
RyR1の減少の結果としてオートファジーが変化する
オートファジーの変化はいくつかの筋疾患で観察されてきた 。 RyR1減少に伴う筋萎縮のメカニズムを明らかにするために、RyR1-Rec筋におけるオートファジーのフラックスの変化を調べた。 オートファゴソームの膜タンパク質である LC3 II の量をウェスタンブロットで定量的に評価したところ、LC3 II の増加が認められた（172% ± 32%, p = 0.03）。 この増加は、オートファゴソームの形成の増加（オートファジー過程の増加による）、またはリソソームとの融合の減少（したがって、オートファジー分解の抑制）のいずれかを反映していると考えられる。 オートファジー フラックス修飾の正確な性質は、オートファジーを介して特異的に分解されるよく知られたタンパク質である p62 の定量によってさらに分析され、その量も有意に増加した (Fig. 7a, b, 172% ± 22%, p = 0.006)． RyR1-Rec筋のLC3 IIとp62が対照と比較して増加したことから、RyR1の減少がオートファジー流束の阻害に関連していることが示唆された。 さらに、オートファジーの2つの阻害因子であるmTORとS6タンパク質の活性化（リン酸化）の増加が観察された（図7b、c）（P-mTOR/mTOR 174%±17%増加、p = 0.01；P-S6/S6 320%±50%増加、p < 0.001 ）。 RyR1-Rec動物におけるこれら2つのオートファジー阻害剤のリン酸化が対照群と比較して増加したことから、RyR1-Rec動物における筋萎縮の原因はオートファジーの阻害であることがさらに示唆された
Autophagy is inhibited in RyR1-Rec D75 mice quadriceps muscle. a, c 4 CTRLおよび4 RyR-Rec quadriceps muscle homogenateに対する代表的なウェスタンブロット b 各グループの8-12マウスにおいてGAPDH量に対して正規化したタンパク質量の定量（CTRL、黒棒； RyR1-Rec 、青棒）。 S6とmTORについては、リン酸化/非リン酸化タンパク質の比率として値を示した。 各動物の値は、少なくとも3つのブロットの平均値である。 すべてのデータは、平均値±SEMとして示される。 CTRL群の平均値は、各タンパク質について1とした。 統計解析。 t test with Holm-Sidak method for multiple comparisons
Human patients’ biopsie exhibit similar defects to those observed in RyR1-Rec mice
In a recent study on a large cohort of patients with a recessive congenital myopathy , we identify the at more than half of the patients with a reducing in RyR1 amount,” dusty cores” という異型構造体が存在することが確認された。 これらは複数の染色法で観察され、境界が不明瞭であること、筋原線維の局所的な乱れ、Gomori trichrome染色での赤紫色の粒状物質の沈着、酸化染色での酵素活性の低下または増加した領域の混在など、従来の中心核（酸化染色を伴わない明確な領域）と異なる（追加ファイル1：図S7）。 これらの構造変化は、我々のマウスモデルで観察された変化を反映している（図4、Additional file 1: 図S7）。 そこで、私たちはさらに、私たちの新しいマウスモデルと、RyR1タンパク質の減少と「ダスティ・コア」を持つ患者の筋生検とを比較した。 定量的ウェスタンブロットを用いて、我々のマウスモデルで明らかに修飾されているタンパク質の量を、劣性ダスティコア病（2つのRyR1変異によりRyR1タンパク質が減少している-図8a）の患者5人においても推定した。 対照として、異なる年齢（3.5歳から64歳まで）の生検を用いた。 すべての患者でRyR1タンパク質の大きな減少が観察された（平均発現量はCTRLの19.8%±2.2%、p < 0.001）。 さらに，CLIMP63とdesminの増加も観察された。 RyR1の減少はCLIMP63の重要な増加と関連していた（平均発現量は5倍、516%±220%増加）。 さらに、デスミンの発現量も対照群に比べ劇的に増加した（平均発現量増加率240倍、24 170% ± 7 635%）。 電子顕微鏡を用いた患者の生検の超微細構造の解析では、すべての患者の無秩序な領域（図8c、矢印）に多くの膜の積み重ねが観察された。 これらの領域は、RyR1-Rec筋で観察されたスタック（図4b）と類似しており、RyR1減少の結果としてこれらの構造が形成される、マウスとヒトの両方に共通するメカニズムであることが指摘された。
Analysis of human patients’ biops reveal similar defects to those observed in RyR1-Rec mice.a representative Western blot performed on muscle homogenate from human biops.DUSTY Core Disease. C1：コントロール、23歳、女性；C2：コントロール、3.5歳、男性；P1：CCD（Dusty core）、突然変異p.M2423K＋p.R2441*、43歳、男性；P2：CCD（Dusty core）、突然変異p.T4709M＋p.R1409*、4歳、男性；P3：CCD（Dusty core）、突然変異p. ＋p.Val788Cysfs*96, 25歳, 女性; P4: CCD (Dusty Core), mutations p.R2140W + p.L4828R, 9歳, 女性; P5: CCD (Dusty Core), mutations p.M4000del + p.Met2312Cysfs*118, 28歳, 女性。 b RyR1, CLIMP63 および Desmin では miosin、 p62 では GAPDH で正規化したタンパク質量の定量化。 データは、10個の対照試料（CTRL）および5個の患者試料（patients）の平均±SEMとして提示されている。 各患者の値は、少なくとも2つのウェスタンブロットの平均値である。 CTRLサンプルの各タンパク質の平均値を1とした。 RyR1発現量をコントロールと比較した。 P1-26±6%、P2-14±6%、P3-20±3%、P4-23±3%、P5-16±2%。 CLIMP63発現量をコントロールと比較。 P1-130% ± 12%, P2-1372% ± 385%, P3-466% ± 92%, P4-262% ± 35%, P5-350% ± 85%). Desminの発現量をコントロールと比較した。 P1-47,789% ± 6097%; P2-10,052% ± 2957%; P3-36,745% ± 7150%; P4-14,951% ± 5584%; P5-11,307% ± 2858%. Student t test RyR1 p < 0.001, CLIMP63 p = 0.016, Desmin p < 0.001 c 診断中に得られた電子顕微鏡写真。患者P2およびP5の生検の無秩序なコア領域に膜のスタックが多数存在することが示される。 5人の患者の筋肉生検でも同様の構造が確認された。 バー 1 µm