転写因子Err3の発現で見分けるγ運動ニューロンとα運動ニューロン

次に、これら2つのサイズ集団内の運動ニューロンへのvGluton入力の頻度を測定した。 高解像度光学顕微鏡を用いてp21脊髄の運動ニューロンへの自己受容入力を再構築し、ChATon運動ニューロン細胞体および近位樹状ドメインへのvGluton端末の付加を決定した。 その結果、小型のChATon運動ニューロン集団にはほとんどvGlut1on端末が接触していなかったが（平均±SEM, 0.4 ± 0.3/neuron; n = 10）、大型ChATon運動ニューロンには18.5 ± 2.3 (n = 10) vGlut1on terminalが接触した（図1 B-F）. これらの知見と他の種における先行解析に基づき、小型で感覚の乏しいニューロンはガンマ運動ニューロンであり、大型で感覚のあるニューロンはアルファ運動ニューロンであると推論した。

Molecular Markers of Presumptive Gamma and Alpha Motor Neurons.

ガンマ運動ニューロンとアルファ運動ニューロンによって異なって発現される分子マーカーを定義するために、我々は、自己受容性感覚ニューロンと運動ニューロンプールによる転写因子と細胞表面分子の発現の共通性（27、28）が、プール内の運動ニューロンのサブセットにも及ぶかもしれないと推論した。 そこで、Affymetrixベースのスクリーニングで同定した自己受容器に富む遺伝子について、p14脊髄のChATon LMC運動ニューロンでの発現を調べた。

この分析により、オーファン核ホルモン受容体Err3の発現が、脊髄の吻側から尾側の全範囲に沿って、ChATon運動ニューロンコホートに散らばる運動ニューロン集団に限定されていることがわかった（図2 AおよびB）。 p14における腰部ChATon運動ニューロンの核内Err3タンパク質発現強度を定量的に解析したところ、頻度ヒストグラムに2つの異なるピークが認められた（図2C）。 低レベルまたは無視できるレベルのErr3発現（平均±SEM、18±1任意蛍光強度単位 、ImageJ）を有する神経細胞は、大きなChATon運動ニューロンに対応し、高レベルErr3発現（222±1 afiu）は小さなChATon運動ニューロンに限定されていた（Fig. 2C）。 Err3の小型運動ニューロンへの発現制限は、生後2週間かけて徐々に起こり、成体まで維持された（図S2）。 しかし、生後早期の段階では、Err3は小型・大型を問わず大多数の運動ニューロンで発現していた（図S3）。

Err3タンパク質が腹側脊髄のニューロンに限定されているかどうかを調べるために、Err3の発現を、ほとんどの哺乳類PNSおよびCNSニューロンのマーカーとして広く使用されているNeuNの発現と関連づけた(24)。 その結果、Err3on/ChATon運動ニューロンにはNeuNの発現が見られないことが判明した。 Err3on/NeuNoff細胞が運動ニューロンであるかどうかを判断するために、運動ニューロンが発現するホメオドメインタンパク質であるHb9の発現を解析した（29, 30）。 Hb9on細胞の核を標的としたLacZを発現させたマウスを用いて、Err3on/NeuNoff細胞におけるHb9の発現状態を評価した(29)。 その結果、Hb9nlsLacZマウスのErr3on/NeuNoff運動ニューロンとErr3off/NeuNon運動ニューロンは同程度のレベルでLacZを発現していた（Fig. 3A）。 脊髄運動ニューロンのもう一つの特徴は、軸索を末梢に投射し、標的筋を神経支配することである。 そこで、Err3on/NeuNoffコリン作動性ニューロンが腹側根に軸索を投射するかどうかを、p16マウスの腰部腹側根を切断し、蛍光標識デキストラン（f-dex）を塗布することによって調べた。 その結果、標識された細胞はすべてコリン作動性であり、Err3off/NeuNonおよびErr3on/NeuNoffの両神経細胞集団は逆行性f-dex標識を蓄積した（Fig. 3B）。 これらの知見は、NeuNoffであるにもかかわらず、これらのニューロンが軸索を末梢に投射していることを示しており、NeuN発現を持たないニューロン亜集団の新たな例となった（24, 31）。 これらの知見と転写プロファイルから、コリン作動性Err3on/NeuNoff細胞は運動ニューロンであることが示された

ガンマおよびアルファ運動ニューロンにおけるErr3およびNeuNの相補的な発現。

Err3発現レベルの高いChATon運動ニューロンが低いNeuN発現と関連しているという観察から、運動ニューロンNeuN発現のプロファイルとErr3との関係をより詳細に検討することになった。 ChATon運動ニューロンにおけるErr3とNeuN強度の複合解析は、2つの標識集団の間に緊密な逆相関を示し（図2A）、Err3の状態が高いChATon運動ニューロンは低いNeuN発現を示すことが示唆された。 この考えを支持するものとして、運動ニューロンをNeuNon/Err3off集団とNeuNoff/Err3on集団に分離し、これら2集団の細胞サイズプロファイルを解析したところ、NeuNon/Err3off分子プロファイルは大きな推定アルファ運動ニューロンに、NeuNoff/Err3onプロファイルは小さな推定ガンマ運動ニューロンに一致した（図2C、左側）。 これらの知見は、Err3とNeuNが異なるサイズのChATon運動ニューロンにおいて相補的な発現パターンを示すことを示し、運動ニューロンのErr3on/NeuNoffおよびErr3off/NeuNon状態が推定上のガンマおよびアルファ運動ニューロンの境界を定めることを示唆するものであった。

分子マーカーによる推定ガンマ運動ニューロンの定量的解析

次に、脊髄の吻側-尾側の範囲に沿って分子的に定義された推定ガンマ運動ニューロンの分布と頻度を解析した。 その結果、Err3on/NeuNoffコリン作動性ニューロンは、解析した全運動ニューロン（n = 349/1172腰部LMC運動ニューロン）の約30%を占め、脊髄の吻側尾側範囲に散在していることが分かった。 さらに、後肢の大腿四頭筋を支配する運動ニューロン群内のガンマモーターニューロンの表現を特徴づけた。 f-dexは注射した筋肉を支配する運動ニューロンの一部しか標識しないので、大腿四頭筋プール内の推定ガンマ運動ニューロンの数をより正確に評価するために、神経病変パラダイムを使用した。 p20マウスの大腿四頭筋を支配する神経を切断し、神経損傷後に運動ニューロンの核で急速に発現が上昇する転写因子ATF3の発現によって、損傷から3日後の大腿四頭筋運動ニューロンの数と分子状態を評価した（32）。 その結果、NeuNonとNeuNoffの両方の大腿四頭筋運動ニューロンがATF3を強固に発現していることがわかった（図3C）。 定量的解析の結果、ATF3onの大腿四頭筋運動ニューロンの約70％がNeuNを共発現し、≈30％がNeuNの発現が低いか無視できる程度であった（Fig. 3C）。 これらの値は、マウスの細胞サイズ基準に基づいて推定ガンマ運動ニューロンの同一性を評価した過去の研究（全運動ニューロンの20-30%がガンマ運動ニューロンであると推定）と一致する（11, 13）。 このように、小型のErr3on/NeuNoff運動ニューロンの分布と頻度は、ガンマ運動ニューロンに期待されるプロファイルに一致すると結論づけた。 筋紡錘の分化と成熟は、新生筋繊維にIa群固有受容性求心性神経から前向性に供給される誘導信号によって開始される（21, 33）。 一方、γ運動ニューロンは、筋紡錘体内部の筋繊維からの栄養支持に依存している（34, 35）。 そこで、もしErr3on/NeuNoffの状態がガンマモーターニューロンを規定するならば、これらのマーカーの発現は筋紡錘体の欠如で失われるはずであると考えた。 紡錘体分化を防ぐために、ジフテリア毒素を介した細胞切除法（PVCreIsl2DTA）を用いて、紡錘体誘導因子Nrg1（21）の供給源である固有感覚神経を排除した（26）。 PVCre Isl2DTAマウスは、p10-p14で解析した後肢筋の自己受容性感覚末端にvGlut1が存在しないのと同様に、脊髄への自己受容性入力が事実上完全に欠如している（26）（図4A）（図S4）。 さらに、Pea3およびEgr3（通常、筋繊維内で選択的に発現する2つの転写因子）の発現喪失によって評価したところ、筋紡錘が完全に欠如していた（図S4）