蛍光抗体法

• By Benedette Cuffari, M.Sc.Reviewed by Emily Henderson, B.Sc.

  1942年の最初の発見以来、免疫蛍光染色は、幅広い研究および診断目的のための非常に信頼性の高い強力な技術であり続けています。

  蛍光分子で標識された白血病細胞。 Image Credit: Vshivkova/.com

  一般に、蛍光抗体法では、蛍光標識でタグ付けされた細胞または抗体を使用します。

  • 直接蛍光抗体
  • 間接蛍光抗体
  • フローサイトメトリー
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  • Benedette Cuffari
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  直接蛍光抗体

  直接蛍光抗体法は、直接免疫蛍光法（DIF）と呼ばれ、標的抗原に結合するために使用される蛍光標識一次抗体の使用を含みます。 臨床的に使用する場合、DIFは、一般に溶連菌として知られているStreptococcus pyogenesや、Mycoplasma pneumoniae、Legionella pneumophiliaなどの細菌性疾患の迅速診断に特に有用である

  このような診断のために、まず患者試料を顕微鏡スライドに置き、蛍光抗体に曝露する。 蛍光標識抗体と標的抗原（このような状況では細菌である）の間の結合は、蛍光顕微鏡での検査時にこれらの物質を照らす原因となる。

  診断ツールとしての使用に加えて、DIFは科学的な研究調査にも広く使用されています。 このような目的のために、5または6マイクロメートル（μm）の薄切片に切断した凍結組織サンプルをスライドガラス上に置きます。

  次にスライドは、蛍光タグ付き抗体とインキュベートされます。

  この種の研究に使用される抗体の濃度は、どの濃度が最高のシグナル／バックグラウンド比を達成できるかを確認した以前の実験に基づくことに留意してください。

  スライドを暗所および室温で少なくとも30分間インキュベートした後、スライドを洗浄し、蛍光顕微鏡で画像化します。

  Image Credit: anyaivanova/.com

  間接蛍光抗体

  DIFに用いられるシングルステップの手法と比較して、間接IF（IIF）または間接FA（IFA）は、標的抗原に対する非標識一次抗体をサンプルに適用することから始まる2ステップのプロセスである。 IIFの第2段階では、一次抗体のFc部分に対して蛍光標識された二次抗体を使用します。

  IIFはDIFよりも時間がかかり、2種類の適合する抗体を使用しなければならないので複雑と考えられていますが、その感度能力の点では優れていると言えます。 この種のIFA検査では、あらかじめ研究動物から分離したT. palladium細胞を分離し、スライドグラスの表面に配置する。 患者から採取した血清をT.パラジウム細胞の上に広げ、抗トレポネマー抗体が存在する場合は、固定した抗原に結合させる。

  患者の血清サンプルを洗い流した後、蛍光色素でタグ付けされた二次抗体を加える。 梅毒の陽性結果は、すべての二次抗体-蛍光剤複合体を照らし出します。

  臨床の場で広く使われているもう一つのタイプのIFAは、全身性エリテマトーデス（SLE）の診断に使われているものです。 自己免疫疾患であるSLEの患者は、DNAとDNAに結合するさまざまなタンパク質の両方を標的とする抗核自己抗体（ANA）の循環レベルが上昇します。

  このタイプのIFA検査では、細胞を培養し、スライドグラスにのせました。

  このタイプのIFAテストでは、細胞は培養され、スライドグラス上に置かれます。各スライドは、異なる濃度の患者の抗体とインキュベートされ、結合しなかったタンパク質を除去するために洗浄されます。

  フローサイトメトリー

  蛍光抗体法の第三のタイプは、フローサイトメトリーで、血液や血清などの複雑な混合物に存在する特定の細胞を定量化するために使用できる自動細胞計数システムである。

  典型的なフローサイトメトリー実験は、Tヘルパー細胞、単球、およびマクロファージを含むさまざまな免疫細胞の表面に見られる糖タンパク質CD4に結合できる抗CD4など、細胞の特定の部分集団に対して標的となっている蛍光ラベル化抗体のインキュベーションから始まります。 フローサイトメトリーでは、適切な細胞メーカーを使用することで、複数の種類の細胞の存在を定量化することもできる。

  インキュベーションが完了した後、サンプルはフローサイトメーターに導入される。 この装置では、細い毛細管によって、サンプル内の細胞が一列に並んで移動する。

  励起された細胞の蛍光強度は、前方散乱および側方散乱検出器で測定され、解析のためにヒストグラムに描かれます。 定量化目的以外にも、フローサイトメトリーと免疫蛍光法は、蛍光活性化セルソーター（FACS）として知られる技術を通じて、研究目的のために細胞を精製した亜集団に仕分けるために使用することができます。 免疫蛍光法のテクニック. Journal of Investigative Dermatology 133. doi:10.1038/jid.2012.455.

• Parker, N., Schneegurt, M., Tu, A. T., et al.（2016）。 第20.5章 蛍光抗体法. In: マイクロバイオロジー. https://openstax.org/books/microbiology/pages/20-5-fluorescent-antibody-techniques.
• Betterle, C., & Zanchetta, R. (2012)からアクセス可能です。 内分泌系自己免疫疾患の診断における免疫蛍光法について． オートイミュニティハイライト3(2); 67-78.

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