目的：

1. 細菌を大きく2つに分類して区別すること。 グラム陽性とグラム陰性。
2. グラム染色反応が、グラム陽性菌とグラム陰性菌の細胞壁の生化学的および構造的差異に基づいて、どのように影響するかを理解する。

Click to view the Animation

Staining is an auxiliary techniques used in microscopic techniques used to enhance the clarity of the microscopic image.

Gram positive と Gram negative の違い。染色や染料は、生物学的標本、細胞、組織などの構造を強調するために科学分野で広く使用されています。

微生物学で最も広く使用されている染色方法は、1884年にデンマークの科学者および医師Hans Christian Joachim Gramが発見したグラム染色（Gram stain）です。 グラム染色は、細菌をグラム陽性とグラム陰性の2群に区別する鑑別染色法である。 この方法は、グラム染色反応の際に使用する染料の色を微生物が保持する能力に基づいている。 グラム陰性菌はアルコールによって脱色され、主染色である紫色を失います。 グラム陽性菌はアルコールで脱色されず、紫色のまま残ります。

Fig: Hans Christian Joachim Gram

Importance of a Gram Stain:

Gram stain is a very important preliminary step in initial characterization and classification of bacteria.これは、グラム染色は、細菌の分類を行う際に、重要な予備段階である。 また、染色特性に基づいて細菌を同定する際にも重要な手順であり、光学顕微鏡を使用して細菌を検査することができるようになります。 染色されていない塗抹標本に存在する細菌は、光学顕微鏡で見ると見えません。 染色すると、細菌の形態や配列も観察することができる。 さらに、患者の直接塗抹などの臨床検体から感染性物質をスクリーニングする際にも重要なステップとなる。

グラム染色法は、細胞壁の化学的・物理的性質の違いを利用して、細菌の染色色の保持を可能にする。

1. グラム陽性菌。 クリスタルバイオレットという一次色素を細胞壁に保持するため、濃い紫色に染まる

例． 黄色ブドウ球菌

Fig: Gram positive bacteria

2. グラム陰性菌。 サフラニンという対抗染色色素を保持しているため、赤やピンクに染まる

例 大腸菌

Fig: Gram negative bacteria

Bacterial Morphology:

Bacteria is very small unicellular microorganisms everywhere in nature.BigLABで、細菌は自然界に普遍的に分布する単細胞の微生物である。 大きさはマイクロメートル（1μm＝10-6m）である。 ペプチドグリカンからなる細胞壁を持ち、二元分裂によって生殖する。 細菌はその形態的特徴も様々である。

最も一般的な形態は以下の通り：

Coccus (pleural: Cocci):

球状の細菌；対で発生したり (diplococci) 、4つのグループ (tetracocci) 、ブドウ状のクラスター (Staphylococci) 、チェーン (Streptococcus) 、8以上の立方体の配置 (sarcinae) であったりする。

たとえば、以下のようなものがある。 Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes

Bacillus (pleural: Bacilli):

Rod-shaped bacteria; generally occur singlely, but sometimes may be found in pairs (diplo-bacilli) or chains (streptobacilli).

for example; Streptococcus aureus (pleural: Bacilli).

#1793> #1771> #1971> #1971> #1971> 例えば: Bacillus cereus, Clostridium tetani

Spirillum (pleural: Spirilla):

Spiral-shaped bacteria

for example.例えば、バチルス菌、クロストリジウム・テタニ。 Spirillum、Vibrio、Spirochete種。

Some bacteria has other shapes such as:

Coccobacilli: Elongated spherical or ovoid form.

Filamentous: 長い鎖か糸で生じるバチルス.

Fusiform.Biacli: Fibrioのような形をしている菌.Sililillum。 先端が細くなっているもの。

Fig: Different bacterial morphology

Gram Stain Mechanism:

Gram Positive Cell Wall.の項参照。

グラム陽性菌は、細胞壁の50-90％がペプチドグリカンからなる厚い網目状の細胞壁を持ち、これが紫色に染色される。 ペプチドグリカンは主にN-アセチルグルコサミンとN-アセチルムラミン酸という2つのサブユニットからなる多糖類である。 隣接するペプチドグリカンの層が形成される際に、トランスペプチダーゼ酵素によって短い鎖状のペプチドが架橋され、細胞壁の形と剛性が得られる。

リポテイコ酸（LTA）もグラム陽性菌の細胞壁の主要な構成成分で、ペプチドグリカン層に埋め込まれている。 リン酸リビトールがグリセリドを介して脂質二重層に固定された長鎖のテイコ酸から構成されている。 自己分解型壁酵素（ムラミダーゼ）の制御因子として働く。

グラム陽性細胞壁の医学的意義：

LTAには抗原性があり、細胞死後に細胞壁から放出されると特異的免疫応答を刺激することもわかっています。 細胞死は、リゾチーム活性、白血球からのカチオン性ペプチド、またはβ-ラクタム系抗生物質によって誘発される溶解に起因している。

グラム陰性菌の細胞壁：

グラム陰性菌はペプチドグリカンの層が薄く（細胞壁の10%）、アルコールリンスで脱色するとクリスタルバイオレット-ヨード複合体が失われるが、カウンターステインのサフラニンは保持するので赤味またはピンク色に見える。

グラム陰性細胞壁の医学的意義：

グラム陰性細菌の細胞壁はしばしば病原細菌が病気を引き起こすための病原性因子である。 グラム陰性菌の病原性は、しばしば細胞壁の特定の成分、特にリポ多糖（別称LPSまたはエンドトキシン）に関連している。 ヒトの場合、LPSはサイトカイン産生と免疫系の活性化を特徴とする自然免疫反応を引き起こす。 サイトカイン産生の結果、炎症が起こり、宿主の毒性も生じます。

Stain Reaction:

グラム染色の基本的な4つのステップ：

1）熱固定した細菌培養の塗抹標本に、第一染色剤のクリスタルバイオレット（CV）を塗布する。

CVは水溶液中でCV+とCl -イオンに解離する。 この2つのイオンはグラム陽性およびグラム陰性細胞の細胞壁と細胞膜を透過する。 CV+イオンはその後、負に帯電した細菌成分と相互作用し、細菌細胞を紫色に染める。

2）グラムヨードの添加

ヨード（I -またはI3 -）は媒染剤および捕捉剤として作用する。 媒染剤とは、主染料と結合することによって細胞壁と染料の親和性を高め、不溶性の複合体を形成して細胞壁に捕捉される物質である。 グラム染色では、クリスタルバイオレットとヨウ素が不溶性の複合体（CV-I）を形成し、塗抹標本が濃い紫色に染まる。 この段階では、すべての細胞が紫色になる。

3）95％エチルアルコールによる脱色アルコールやアセトンは、グラム陰性菌の脂質外膜を溶かし、ペプチドグリカン層をむき出しにして、細胞壁の多孔性を増加させる。

一方、アルコールはグラム陽性菌の細胞壁を脱水する作用があり、細胞壁の孔を縮小させる作用がある。 CV-I複合体は多層で高度に架橋されたグラム陽性菌の細胞壁にしっかりと結合し、細胞を紫色に染色します。

脱色工程は慎重に行わなければならず、さもなければ過剰脱色が起こる可能性があります。 このステップは非常に重要で、正しいタイミングで行わなければ、グラム陽性細胞からクリスタルバイオレット染色が除去されてしまいます。 また、脱色剤の塗布時間が長すぎると、グラム陽性菌がグラム陰性に見えてしまう。

4) サフラニンによる対染色

脱色したグラム陰性細胞は、適当な対染色剤で可視化することができる。対染色剤は通常正電荷のサフラニンで、ピンク色に染色される。 グラム陽性菌に付着したピンク色はクリスタルバイオレットの紫色で覆い隠される（まれにサフラニンの代わりにベーシックフシンが使われることもある）

。