クッシング症候群の診断は、病歴、身体検査、実験室検査の検討に基づいて行われ、コルチゾールの過剰レベルの存在を判断するのに役立ちます。 副腎や下垂体のX線検査は、しばしば腫瘍の位置を特定するのに有効です。 さらに、クッシング症候群を発症した患者さんでは、昔と最近の写真を比較することで、顔や体の外見の変化が強調されることがよくあります。 クッシング病の診断の第一歩は、コルチゾールの過剰分泌の存在を確認することである。 この診断は、以下の検査によって最も容易に行われる：
- 低用量デキサメタゾン抑制試験これは、午後11時にコルチゾール類似薬のデキサメタゾンを少量（1mg）服用し、翌朝にコルチゾールの採血をするものである。 正常な人は通常、これらのサンプル中のコルチゾールのレベルが非常に低く、ACTH分泌が抑制されていることを示すが、クッシング病の患者ではコルチゾールは容易に検出され、しばしば増加する。
- コルチゾールレベルを測定するための24時間尿採取
いったんクッシング症候群の診断が下されると、過剰コルチゾールの原因を決定する必要がある。 その原因は、副腎腫瘍、ACTH産生腫瘍、または下垂体ACTH産生腺腫に由来するものである可能性がある。 ペトロサル洞サンプリングは、ACTH分泌源を区別するために用いられる検査であり、クッシング症候群の診断が確立される前に決して実施すべきではない
検査室検査でクッシング症候群の原因として下垂体腺腫が示唆された場合、診断を確定するために下垂体磁気共鳴画像（MRI）が行われる
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