In vivo RyR1-Reduktion im Muskel löst eine kernartige Myopathie aus

Generation des RyR1Flox/Flox::HSA-Cre-ERT2-Mausmodell

Eine Mauslinie mit loxP-Stellen, die auf beiden Seiten der Exons 9-11 des RYR1-Gens eingefügt wurden (sog. RyR1Flox/Flox), wurde mit der Mauslinie HSA-Cre-ERT2 gepaart, die die Tamoxifen-abhängige Cre-ERT2-Rekombinase unter der Kontrolle des menschlichen α-Actin-Gens für Skelettmuskeln exprimiert, um RyR1Flox/Flox::HSA-Cre-ERT2 zu erzeugen. Die Injektion von Tamoxifen induziert die Aktivierung der Cre-ERT2-Rekombinase selektiv im Skelettmuskel, was zur Deletion der Exons 9-11 und zur Unterbrechung des RYR1-Gens im Skelettmuskel mit strikter Tamoxifen-Abhängigkeit führt (Abb. 1a). Bei der Geburt waren die RyR1Flox/Flox::HSA-Cre-ERT2-Mäuse normal, und im Alter von 2 Monaten, als junge Erwachsene, wurde die Rekombination durch eine Tamoxifen-Injektion ausgelöst (ab diesem Zeitpunkt wurden die rekombinierten Tiere als RyR1-Rec bezeichnet). Die molekularen und physiologischen Folgen wurden in Abhängigkeit von der Zeit bis zu 105 Tage nach der Induktion der Rekombination untersucht (Abb. 1b). Kontrolltiere (CTRL) sind Wurfgeschwister RyR1Flox/Flox (ohne das HSA-Cre-ERT2-Transgen), denen Tamoxifen injiziert wurde. Der Gesamtphänotyp der rekombinierten Mäuse ist nach 75 Tagen durch eine Kyphose in Verbindung mit einer abnormen Beweglichkeit der Hintergliedmaßen und einem watschelnden Gang gekennzeichnet. Die Tiere sind immer noch in der Lage, sich auf die Hinterbeine zu stellen, um zu fressen, aber mit fortschreitender Krankheit wurden systematisch Futterpellets direkt in den Käfig gegeben. Nach 105 Tagen sind die Tiere immer noch mobil in ihren Käfigen und es wurde keine erhöhte Sterberate im Vergleich zu CTRL beobachtet. Sowohl männliche als auch weibliche Tiere waren betroffen. Die relative Menge von RyR1 auf mRNA-Ebene wurde im Quadrizepsmuskel alle 15 Tage nach der Rekombination mittels RT-q-PCR bei CTRL- und bei RyR1-Rec-Tieren analysiert (Abb. 1c). Es wurde ein schneller Abfall der RyR1-mRNA beobachtet, wobei bereits 3 Tage nach der Tamoxifen-Injektion ein niedriger und stabiler Wert von 21 % ± 4 % des Ausgangswertes erreicht wurde. Ein Rückgang wurde in allen getesteten Muskeln 75 Tage nach der Rekombinationsinduktion beobachtet (Quadriceps, Tibialis anterior, EDL, Soleus, Additional file 1: Abb. S1A). Die Menge des RyR1-Proteins wurde im Quadrizeps-Muskelhomogenat mittels quantitativem Western Blot weiter analysiert (Abb. 1d, e). Diese Menge wurde schrittweise reduziert und erreichte nach 105 Tagen etwa 50 % des Ausgangswertes. Bei längeren Zeiträumen wurde keine weitere Verringerung des RyR1-Proteins beobachtet (Daten nicht gezeigt). Die Menge des RyR1-Proteins wurde in verschiedenen Muskelhomogenaten 75 Tage nach der Rekombination quantifiziert. Eine Reduktion wurde in allen untersuchten Muskeln beobachtet, obwohl sich die verbleibende Menge zwischen den Muskeln leicht unterschied, wobei die höchste Menge im Interossus (64 % ± 5 %) und die niedrigste im Soleus (33 % ± 5 %) zu finden war (Additional file 1: Fig. S1B).

RyR1-Rec-Mäuse zeigen eine fortschreitende Reduktion des Muskel- und Körpergewichts sowie der Muskelkraft

Die Folgen der RyR1-Reduktion wurden zunächst am ganzen Tier untersucht. Bei anfänglich gleichem Gewicht nahmen die CTRL-Tiere langsam zu, von 24,4 ± 0,4 auf 30,6 ± 0,8 g bei D90, während die RyR1-Rec-Tiere progressiv an Gewicht verloren, auf 20,6 ± 1,3 g bei D90 (Abb. 2a). Sowohl Männchen als auch Weibchen waren betroffen und verloren nach 75 Tagen etwa 13 % ihres ursprünglichen Körpergewichts (Additional file 1: Fig. S1C). Dies ist das Ergebnis eines Gewichtsverlustes, der in allen Muskeln beobachtet wurde (Additional file 1: Fig. S1D). Um die allgemeine Muskelleistung nach der RyR1-Reduktion zu testen, wurden die Tiere zwei verschiedenen Krafttests unterzogen. Zunächst durften sie mit allen vier Pfoten bis zu 5 Minuten lang an einer quer verdrahteten Fläche hängen, wobei die Latenzzeit bis zum Fallen die Muskelkraft widerspiegelt. Der Grifftest, der 105 Tage lang jede Woche durchgeführt wurde (Abb. 2b), zeigte, dass die RyR1-Rec-Tiere 20-30 Tage nach der Tamoxifen-Injektion an Kraft verloren, als die RyR1-Menge etwa 75-80 % ihres ursprünglichen Wertes betrug, und dass sie etwa 75 Tage nach der Tamoxifen-Injektion nicht mehr in der Lage waren, am Gitter zu hängen, da die RyR1-Menge etwa 60 % erreicht hatte. Die Muskelkraft wurde auch durch ein 6-minütiges nichtinvasives Elektrostimulationsprotokoll des Gastrocnemius-Muskels in Verbindung mit einer anatomischen Magnetresonanztomographie (MRT) unter Vollnarkose bewertet. Während des Elektrostimulationsprotokolls der CTRL-Tiere 30 Tage nach der Tamoxifen-Injektion (Abb. 2c, D30) wurde ein typisches Bewegungsprofil aufgezeichnet, mit einer stabilen anfänglichen Muskelkraft, die mit zunehmender Muskelermüdung langsam abnahm. In der CTRL-Gruppe zeigte das Bewegungsprofil bei D60 und D90 eine Verbesserung der Muskelkraft, als die Tiere älter wurden (Abb. 2c). Im Gegensatz dazu verschlechterte sich die Leistung der RyR1-Rec-Tiere, ähnlich wie bei der CTRL-Gruppe bei D30, mit dem Alter. RyR1-Rec-Tiere waren bei D90 nicht mehr in der Lage, die Übung auszuführen (Abb. 2c, RyR1-Rec D90). Das anhand von MR-Bildern gemessene Volumen des Gastrocnemius (Abb. 2d) blieb bei CTRL-Tieren von D30 (161 ± 5 mm3) bis D90 (164 ± 4 mm3) stabil. Im Gegensatz dazu war das Volumen des Gastrocnemius bei RyR1-Rec-Mäusen seit D30 signifikant kleiner als bei CTRL-Mäusen (141 ± 3 mm3, p = 0,003) und wurde weiter reduziert auf 100 ± 3 mm3 bei D60 (p < 0,001 im Vergleich zu CTRL im gleichen Alter) und 69 ± 4 mm3 bei D90 (p < 0,001 im Vergleich zu CTRL im gleichen Alter). Die maximale spezifische Zuckungsspannung (absolute Zuckungsspannung normalisiert auf das Muskelvolumen) bestätigt, dass beide Gruppen bei D30 eine ähnliche Muskelkraft aufwiesen (Abb. 2e), aber die Kraft der RyR1-Rec-Tiere nahm dramatisch ab, während sie bei den CTRL-Tieren mit zunehmendem Alter anstieg. Darüber hinaus wurden die Veränderungen in der Bioenergetik des Gastrocnemius-Muskels während der Elektrostimulation bei D60 nichtinvasiv mittels In-vivo-31-Phosphor-(31P)-MR-Spektroskopie untersucht. Während sich der basale intramyofibrilläre pH-Wert zwischen den beiden Gruppen nicht unterschied (Zusätzliche Datei 1: Abb. S2A), war das Ausmaß der Azidose am Ende der Übung bei RyR1-Rec-Tieren geringer (p = 0,016) (Zusätzliche Datei 1: Abb. S2B), was darauf hindeutet, dass der glykolytische Fluss im trainierenden Muskel bei diesen Tieren reduziert war. Darüber hinaus war die Zeitkonstante der Phosphokreatin-Resynthese nach dem Training (τPCr) bei RyR1-Rec-Mäusen signifikant kürzer (p = 0,047) (Additional file 1: Abb. S2C, D), was auf eine verbesserte mitochondriale Funktion in vivo hinweist. Tatsächlich beruht die PCr-Synthese während der Erholungsphase nach dem Training ausschließlich auf der oxidativen ATP-Synthese, so dass τPCr als Index für die oxidative Phosphorylierungskapazität angesehen wird. Insgesamt deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass eine progressive Reduktion von RyR1 mit einem progressiven Gewichtsverlust und einer Abnahme der Muskelkraft einhergeht.

Die physiologischen Eigenschaften isolierter Fasern sind bei RyR1-Rec-Mäusen beeinträchtigt

Die Veränderung der Muskelfunktion wurde auf der Ebene der einzelnen Muskelfaser durch eine Kombination aus Ganzzellenspannungsmessung und konfokaler Bildgebung weiter charakterisiert. Das T-Tubuli-Netzwerk wurde durch Anfärben der Plasmamembran mit di-8-anepps abgebildet. Es wurde kein qualitativer Unterschied im Netzwerk (Abb. 3a, links) oder ein quantitativer Unterschied in der mittleren T-Tubuli-Dichte zwischen CTRL- und RyR1-Rec-Fasern beobachtet, abgesehen von einer leichten, aber signifikanten Verkürzung der mittleren Sarkomerlänge in Ruhe (Abb. 3a, Grafiken rechts). Der spannungsaktivierte Ca2+-Einstrom durch die DHPR (Abb. 3b-d) und der Ca2+-Freisetzungsfluss durch RyR1 (Abb. 3e-i) wurden gleichzeitig untersucht. Im Vergleich zu CTRL-Fasern zeigten RyR1-Rec-Fasern spannungsaktivierte DHPR-Ca2+-Ströme mit ähnlichem Zeitverlauf (Abb. 3b), aber geringerer Dichte, wie die Spitzenstromdichte im Vergleich zur Spannung in den beiden Gruppen zeigt (Abb. 3c), was zu einer 30 %igen Verringerung der maximalen Leitfähigkeit (Gmax) führte, ohne dass sich die anderen Parameter der Strom-Spannungs-Beziehung veränderten (Abb. 3d). Die Spannungsabhängigkeit der SR-Ca2+-Freisetzung wurde anhand von Line-Scan-Bildern des Ca2+-sensitiven Farbstoffs rhod-2 untersucht. Die Line-Scan-Bilder der RyR1-Rec-Fasern ähnelten qualitativ denen der CTRL-Fasern (Abb. 3e) und zeigten einen schnellen Anstieg der Fluoreszenz bei Depolarisation der T-Tubuli-Membran, der räumlich homogen entlang der gescannten Linie verlief. Die Rate der SR-Ca2+-Freisetzung (Abb. 3g), berechnet aus den Veränderungen der Rhod-2-Fluoreszenz, die durch Depolarisationsimpulse mit zunehmender Amplitude ausgelöst werden (Abb. 3f), zeigte in RyR1-Rec-Fasern einen ähnlichen Zeitverlauf wie in CTRL-Fasern, aber vor allem waren die Spitzenwerte in RyR1-Rec reduziert. Die Anpassung der Spitzenrate der SR-Ca2+-Freisetzung gegen die Spannung (Abb. 3h oben) zeigte, dass die maximale Rate der Ca2+-Freisetzung in der RyR1-Rec-Gruppe um 25 % reduziert war (Abb. 3i, Max), der Steigungsfaktor (k) war ebenfalls leicht, aber signifikant reduziert, während die Spannung der mittleren Aktivierung (V0,5) unverändert blieb. In den RyR1-Rec-Fasern wurde ein leichter (im Durchschnitt 1,3 ms), aber signifikanter Anstieg der Zeit bis zum Spitzenwert der SR-Ca2+-Freisetzung beobachtet (Abb. 3h, untere Grafik). Bei der Fähigkeit der Fasern, zytosolisches Ca2+ zu entfernen (SERCA-Pumpenfunktion), die mit dem Ca2+-sensitiven Farbstoff Fluo-4 FF unter nicht-EGTA-gepufferten Bedingungen gemessen wurde, wurden keine Veränderungen beobachtet (Additional file 1: Fig. S3). Insgesamt zeigen diese Ergebnisse, dass die 35%ige Verringerung der RyR1-Menge in der Interossa mit einer 30%igen Verringerung des Kalziumstroms durch DHPR und einer 25%igen Verringerung des Kalziumflusses durch RyR1 verbunden ist.

RyR1-Reduktion beeinflusst die Skelettmuskelstruktur

Um die Grundlage dieser funktionellen Veränderungen, die mit einer Abnahme von RyR1 verbunden sind, besser zu verstehen, wurde die Muskelstruktur bei RyR1-Rec-Tieren bei D75 nach der Rekombination untersucht und mit CTRL-Tieren verglichen. Der Extensor digitorum longus (EDL), ein schnell zuckender Muskel, der Soleus, ein langsam zuckender Muskel, und der Tibialis anterior (TA), ein gemischter Muskel, wurden mit Hämatoxylin-Eosin-, NADH- und Gomori-Trichrom-Färbungen analysiert. Die Färbungen des TA, die in Abb. 4a dargestellt sind, zeigen eine abnorme Muskelstruktur bei RyR1-Rec-Tieren, ohne Fibrose oder zentrale Kerne, aber mit Faserschwund, der sowohl Typ-I- als auch Typ-II-Fasern betrifft (Tabelle 2). Eine Desorganisation der Mitochondrien, die durch eine lokale Anhäufung/Abnahme in benachbarten Regionen derselben Faser gekennzeichnet ist (Pfeilkopf und Einfügung in Abb. 4a), sowie eine Anhäufung roter Färbung mit Gomori-Trichrom (Additional file 1: Fig. S4) wurde ebenfalls beobachtet und ähnelt den staubigen Kernen, die kürzlich bei Patienten beschrieben wurden. Eine Faseratrophie wurde bei beiden Fasertypen in der EDL beobachtet, obwohl der Rückgang bei den Fasern des Typs I etwas ausgeprägter war (Tabelle 2). Transversale TA-Schnitte von CTRL- und RyR1-Rec-Mäusen wurden mit Antikörpern gegen RyR1 und Desmin angefärbt. Es wurde keine Veränderung in der RyR1-Verteilung zwischen Typ-I- und Typ-II-Fasern in RyR1-Rec-TA-Schnitten beobachtet, was auf eine ähnliche RyR1-Reduktion in allen Fasertypen hinweist (Abb. 4b). Überraschenderweise wurde eine wichtige Veränderung in der Desmin-Verteilung beobachtet, mit einem enormen Anstieg in den kleinen Typ-I-Fasern (Abb. 4b): In CTRL-TA-Schnitten wiesen alle Fasern eine ähnliche periphere Färbung auf, während die kleinen Typ-I-Fasern in RyR1-Rec-TA-Schnitten sowohl in der Faserperipherie als auch im Zytosol stark gefärbt waren (Inset Abb. 4b). Obwohl die IF-Markierung nicht quantitativ ist, zeigen diese Ergebnisse, dass die RyR1-Reduktion höchstwahrscheinlich homogen war, ohne große Unterschiede zwischen benachbarten Fasern, wie sie bei Desmin beobachtet wurden, wobei die Quantifizierung, die durch den Western Blot durchgeführt wurde, der Spiegel des in jeder Faser enthaltenen Proteins ist und nicht ein Mittelwert von Fasern mit 0% RyR1 und Fasern mit 100% RyR1 innerhalb desselben Muskels.

Die Organisation der Triaden wurde weiter untersucht, indem isolierte EDL-Fasern immunfluoreszierend markiert wurden (Abb. 5a). Die Markierung von Alpha-Actinin (als Marker der Z-Linie), Triadin und RyR1 (als Triadenmarker) auf RyR1-Rec-EDL-Fasern zeigte, dass die Verringerung der RyR1-Menge zu einer allgemeinen Desorganisation der Faser mit abnormaler Triadenlokalisierung und Unterbrechung der Z-Linie führte, wobei Triadin und RyR1 jedoch noch teilweise kolokalisiert waren. Obwohl die Triaden auf beiden Seiten der Z-Linie verblieben, bildete die Z-Linie keine gerade Linie wie bei CTRL und wies stattdessen viele Mikrounterbrechungen auf (Inset Abb. 5a). Die Ultrastruktur des Muskels wurde mittels Elektronenmikroskopie an RyR1-Rec EDL-Fasern bei D75 analysiert (Abb. 5b). Einige Regionen wiesen eine relativ gut erhaltene Struktur auf (Abb. 5b, linke Faser), während einige angrenzende Regionen stark desorganisiert waren, mit einer Störung der regelmäßigen Organisation der Sarkomere, einer Desorganisation der Mitochondrien und dem Vorhandensein zahlreicher Membranstapel (Abb. 5b, Pfeile, vergrößert in der Beilage), die früher als multiple Triaden bezeichnet wurden. Die morphologischen Merkmale dieser multiplen Triaden im Vergleich zu den normalen Einzeltriaden sind in Tabelle 3 dargestellt, und weitere Beispiele sind in Zusatzdatei 1 zu finden: Abb. S5. Die genaue Quantifizierung der mutmaßlichen T-Tubuli-Breite, der mutmaßlichen SR-Breite und des Intermembranraums (T-Tubuli/SR) (Additional file 1: Abb. S5) zeigte eine enorme Zunahme der mittleren T-Tubuli-Größe in diesen multiplen Triaden (zweifache Zunahme, 202 % der T-Tubuli-Größe in der normalen Triade), während die mittlere SR-Breite nur geringfügig zunahm (+ 10 %) und der Intermembranraum nicht verändert wurde. Diese Ergebnisse deuten auf eine allgemeine strukturelle Desorganisation der Muskeln von RyR1-Rec-Mäusen hin, die mit einer Umgestaltung der Membranen einhergeht.

RyR1-Reduktion ist mit einer Veränderung der Menge zahlreicher Proteine verbunden

Die Folgen der RyR1-Reduktion wurden auf molekularer Ebene mittels quantitativem Western Blot am Quadrizepsmuskel von CTRL- oder RyR1-Rec-Mäusen (8 Tiere in jeder Gruppe) bei D75 nach Tamoxifen-Injektion untersucht (Abb. 6). Die relative Menge zahlreicher Proteine, die direkt oder indirekt an der Kalziumverarbeitung beteiligt sind, wurde geschätzt, wobei als Referenz die Gesamtmenge der Proteine verwendet wurde, die durch eine färbungsfreie Auswertung bestimmt wurde. Es wurde kein Unterschied in der Quantifizierung von RyR1 zwischen dieser Methode und der Verwendung der schweren Myosinkette als Referenzprotein festgestellt (Vergleich zwischen Abb. 1, 6). Keine signifikante Veränderung zwischen CRTL- und RyR1-Rec-Muskeln wurde bei der Menge der Triadin-Isoform T95, des Kalziumbindungsproteins CSQ1, der Ca2+-ATPase SERCA, der mitochondrialen FoF1-ATPase und der Alpha-1-Untereinheit von DHPR festgestellt (Abb. 6a, b). Im Gegensatz dazu wurde ein Anstieg der Menge von STIM1 (× 3,7 ± 1, p = 0,02), der Triadin-Isoform T51 (× 1,6 ± 0,1, p < 0,001), CLIMP63 (× 1,8 ± 0,2, p = 0,004) und ORAI1 (× 3,7 ± 1, p = 0,017) beobachtet. Da eine Veränderung der Lokalisation des Strukturproteins Desmin mittels Immunfluoreszenzmarkierung beobachtet wurde (Abb. 5b), wurde auch die Desmin-Expressionsmenge quantifiziert, wobei ein enormer Anstieg der Desmin-Menge beobachtet wurde (× 8,2 ± 1,2, p = 0,001). Die Lokalisierung von CLIMP63 und STIM1 in RyR1-Rec-EDL-Fasern wurde mittels Immunfluoreszenzmarkierung analysiert, und es wurde keine wesentliche Veränderung beobachtet (Additional file 1: Fig. S6). Die Verringerung des RyR1-Proteins war also mit einer Zunahme verschiedener Proteine verbunden, die an der Kalziumregulierung oder an der Muskelarchitektur beteiligt sind.

Autophagie ist durch die RyR1-Reduktion verändert

Eine Veränderung der Autophagie wurde bei einigen Myopathien beobachtet. Um die Mechanismen zu identifizieren, die zur Muskelatrophie nach einer RyR1-Reduktion führen, haben wir nach Veränderungen im Autophagie-Fluss in RyR1-Rec-Muskeln gesucht. Die Menge an LC3 II, einem Membranprotein der Autophagosomen, wurde mit einem quantitativen Western Blot ausgewertet (Abb. 7a, b), und es wurde ein Anstieg von LC3 II beobachtet (172 % ± 32 %, p = 0,03). Diese Zunahme der Autophagosomen könnte entweder auf eine vermehrte Bildung von Autophagosomen (aufgrund eines verstärkten Autophagieprozesses) oder auf eine Abnahme ihrer Fusion mit Lysosomen (und damit auf eine Hemmung des Autophagieabbaus) zurückzuführen sein. Die genaue Art der Veränderung des Autophagieflusses wurde durch die Quantifizierung von p62, einem bekannten Protein, das spezifisch über die Autophagie abgebaut wird, weiter analysiert, dessen Menge ebenfalls signifikant erhöht war (Abb. 7a, b, 172 % ± 22 %, p = 0,006). Der damit verbundene Anstieg von LC3 II und p62 im RyR1-Rec-Muskel im Vergleich zur Kontrolle deutet darauf hin, dass die RyR1-Reduktion mit einer Hemmung des Autophagie-Flusses verbunden war. Darüber hinaus wurde ein Anstieg der Aktivierung (Phosphorylierung) von zwei Inhibitoren der Autophagie, mTOR und S6-Protein (Abb. 7b, c), beobachtet (P-mTOR/mTOR Anstieg um 174% ± 17%, p = 0,01; P-S6/S6 Anstieg um 320% ± 50%, p < 0,001). Der Anstieg der Phosphorylierung dieser beiden Autophagie-Inhibitoren bei RyR1-Rec-Tieren im Vergleich zu den Kontrollen deutet weiter auf eine Hemmung der Autophagie hin, die für die Muskelatrophie bei RyR1-Rec-Tieren verantwortlich ist.

Biopsien von menschlichen Patienten weisen ähnliche Defekte auf wie die in RyR1-Rec-Mäusen beobachteten

In einer kürzlich durchgeführten Studie an einer großen Kohorte von Patienten mit einer rezessiven kongenitalen Myopathie haben wir bei mehr als der Hälfte der Patienten mit einer Verringerung der RyR1-Menge das Vorhandensein atypischer Strukturen, so genannter „staubiger Kerne“, festgestellt. Sie wurden durch Mehrfachfärbung beobachtet und unterscheiden sich vom klassischen zentralen Kern (gut definierte Regionen ohne oxidative Färbung) durch ihre schlecht definierten Grenzen, ihre fokale myofibrilläre Desorganisation, eine rötlich-violette körnige Materialablagerung bei der Gomori-Trichrom-Färbung und einen gemischten Bereich mit verringerter oder/und erhöhter enzymatischer Aktivität bei oxidativen Färbungen (Additional file 1: Abb. S7). Diese strukturellen Veränderungen spiegeln die in unserem Mausmodell beobachteten Veränderungen wider (Abb. 4 und Additional file 1: Fig. S7). Wir haben daher unser neues Mausmodell mit Muskelbiopsien von Patienten mit einer RyR1-Proteinreduktion und „staubigen Kernen“ verglichen. Mittels quantitativem Western Blot wurde die Menge der Proteine, die in unserem Mausmodell eindeutig verändert waren, auch bei 5 Patienten mit einer rezessiven Dusty-Core-Krankheit (zwei RyR1-Mutationen, die zu einer RyR1-Proteinreduktion führen – Abb. 8a) geschätzt. Kontrollbiopsien unterschiedlichen Alters (zwischen 3,5 und 64 Jahren) wurden als Referenz verwendet. Bei allen Patienten wurde eine starke Verringerung des RyR1-Proteins beobachtet (mittleres Expressionsniveau 19,8 % ± 2,2 % von CTRL, p < 0,001). Darüber hinaus wurde auch ein Anstieg von CLIMP63 und Desmin beobachtet. Die Verringerung von RyR1 ging mit einem deutlichen Anstieg von CLIMP63 einher (mittlerer Anstieg des Expressionsniveaus um das Fünffache, 516 % ± 220 %). Darüber hinaus war auch die Expression von Desmin bei den Patienten im Vergleich zur Kontrolle drastisch erhöht (mittlere Expressionssteigerung um das 240-fache, 24 170 % ± 7 635 %). Bei der elektronenmikroskopischen Analyse der Ultrastruktur der Patientenbiopsie wurden in den desorganisierten Regionen (Abb. 8c, Pfeile) bei allen Patienten zahlreiche Membranstapel beobachtet. Diese Regionen ähneln den Stapeln, die im RyR1-Rec-Muskel beobachtet wurden (Abb. 4b), und deuten auf einen gemeinsamen Mechanismus hin, der sowohl bei Mäusen als auch bei Menschen zur Bildung dieser Strukturen als Folge der RyR1-Reduktion führt. Mit identischen Modifikationen wie bei Patienten mit Dusty-Core-Krankheit stellt dieses Modell somit ein relevantes Modell zur Untersuchung der pathophysiologischen Mechanismen dar.