Fluoreszierende Antikörpertechniken

Von Benedette Cuffari, M.Sc.Überprüft von Emily Henderson, B.Sc.

Seit ihrer ursprünglichen Entdeckung im Jahr 1942 ist die Immunfluoreszenzfärbung eine äußerst zuverlässige und leistungsfähige Technik für ein breites Spektrum von Forschungs- und Diagnosezwecken geblieben.

Mit fluoreszierenden Molekülen markierte Leukämiezellen. Image Credit: Vshivkova/.com

Im Allgemeinen werden bei Fluoreszenz-Antikörper-Techniken (FA) Zellen oder ein Antikörper verwendet, dessen konstante Region mit einem fluoreszierenden Marker, einem so genannten Fluorophor, versehen ist. FA-Techniken werden oft als direkt oder indirekt kategorisiert.

Direkte Fluoreszenz-Antikörper

Die direkte Fluoreszenz-Antikörper-Technik, die auch als direkte Immunfluoreszenz (DIF) bezeichnet werden kann, beinhaltet die Verwendung eines einzelnen fluoreszenzmarkierten primären Antikörpers, der an ein Zielantigen gebunden wird. Bei der klinischen Anwendung ist die DIF besonders nützlich für die schnelle Diagnose von bakteriellen Erkrankungen wie Streptococcus pyogenes, besser bekannt als Streptokokken, sowie von Lungenentzündungen, die durch Mycoplasma pneumoniae und Legionella pneumophilia verursacht werden.

Für solche diagnostischen Zwecke wird die Patientenprobe zunächst auf einen Objektträger gelegt und dann dem fluoreszierenden Antikörper ausgesetzt. Jede Bindung zwischen dem mit einer Fluoreszenzmarkierung versehenen Antikörper und dem Zielantigen, bei dem es sich in diesem Fall um Bakterien handelt, bewirkt, dass diese Substanzen bei der Untersuchung mit einem Fluoreszenzmikroskop aufleuchten.

Neben der Verwendung als diagnostisches Hilfsmittel wird DIF auch häufig für wissenschaftliche Forschungsstudien eingesetzt. Zu diesem Zweck wird eine gefrorene Gewebeprobe, die in 5 oder 6 Mikrometer (µm) dünne Schnitte geschnitten wurde, auf einen Objektträger aus Glas gelegt.

Die Objektträger werden dann mit einem fluoreszenzmarkierten Antikörper inkubiert, der in der Regel eine Reihe von Antikörpern umfasst, die gegen die Antikörper-Isotypen IgA, IgG und IgM sowie Komplement 3 gerichtet sind, das sich gegen das betreffende Antigen richtet.

Die Konzentration des Antikörpers, der für diese Art von Studie verwendet wird, basiert auf früheren Experimenten, die bestätigt haben, welche Konzentration das höchste Signal-Hintergrund-Verhältnis erzielen kann.

Nachdem die Objektträger mindestens 30 Minuten im Dunkeln und bei Raumtemperatur inkubiert wurden, werden sie gewaschen und anschließend mit einem Fluoreszenzmikroskop abgebildet.

Image Credit: anyaivanova/.com

Indirekter Fluoreszenz-Antikörper

Im Vergleich zur einstufigen Technik der DIF ist die indirekte IF (IIF) oder indirekte FA (IFA) ein zweistufiger Prozess, der mit der Aufbringung eines unmarkierten primären Antikörpers auf die Probe beginnt, der gegen ein Zielantigen gerichtet ist. Der zweite Schritt der IIF beinhaltet die Verwendung eines fluoreszenzmarkierten sekundären Antikörpers, der gegen den Fc-Teil des primären Antikörpers gerichtet ist.

Obwohl die IIF als komplizierter als die DIF gilt, da sie länger dauert und die Verwendung von zwei kompatiblen Antikörpern erfordert, ist sie hinsichtlich ihrer Empfindlichkeit überlegen.

Zu den häufigen klinischen Anwendungen von IFA-Tests gehören diejenigen, die zur Diagnose von Syphilis verwendet werden. Bei dieser Art von IFA-Test werden T. palladium-Zellen, die zuvor aus einem Versuchstier isoliert wurden, isoliert und auf die Oberfläche eines Glasträgers aufgebracht. Ein Serum, das einem Patienten entnommen wurde, wird dann auf die T. palladium-Zellen aufgetragen, damit sich Antitreponem-Antikörper, sofern vorhanden, an die fixierten Antigene binden können.

Nach dem Auswaschen der Serumprobe des Patienten wird ein mit einem Fluorophor markierter sekundärer Antikörper hinzugefügt. Ein positives Syphilis-Ergebnis lässt alle sekundären Antikörper-Fluorophor-Konjugat-Komplexe aufleuchten.

Eine andere Art von IFA, die in der klinischen Praxis weit verbreitet ist, wird für die Diagnose des systemischen Lupus erythematodes (SLE) verwendet. Patienten mit SLE, einer Autoimmunerkrankung, weisen einen erhöhten Spiegel an zirkulierenden antinukleären Autoantikörpern (ANA) auf, die sich sowohl gegen die DNA als auch gegen verschiedene Proteine richten, die an die DNA binden.

Für diese Art von IFA-Test werden Zellen kultiviert und dann auf einen Glasträger gegeben. Jeder Objektträger wird dann mit einer anderen Konzentration des Antikörpers des Patienten inkubiert, der dann gewaschen wird, um ungebundene Proteine zu entfernen.

Nach dem Waschschritt wird ein fluoreszenzmarkierter sekundärer Antikörper, bei dem es sich für den ANA-Test um Antihuman-IgG handelt, auf die Objektträger gegeben und inkubiert. Der ANA-Titer im Serum wird dann anhand der höchsten Serumverdünnung, die Fluoreszenz gezeigt hat, ermittelt und zur Bestimmung der SLE-Diagnose verwendet.

Durchflusszytometrie

Die dritte Art der Fluoreszenzantikörpertechnik umfasst die Durchflusszytometrie, ein automatisiertes Zellzählsystem, das zur Quantifizierung spezifischer Zellen in komplexen Gemischen wie Blut oder Serum verwendet werden kann.

Ein typisches Durchflusszytometrie-Experiment beginnt mit der Inkubation eines fluoreszierend markierten Antikörpers, der sich gegen eine bestimmte Unterpopulation von Zellen richtet, wie z. B. Anti-CD4, der an das Glykoprotein CD4 auf der Oberfläche verschiedener Immunzellen wie T-Helferzellen, Monozyten und Makrophagen binden kann. Die Durchflusszytometrie kann auch das Vorhandensein mehrerer Zelltypen quantifizieren, indem geeignete Zellhersteller verwendet werden.

Nach Abschluss der Inkubation wird die Probe dann in das Durchflusszytometer gegeben. In diesem Gerät zwingt eine schmale Kapillare die in der Probe vorhandenen Zellen, sich in einer einzigen Reihe zu bewegen. Während sich die Zellen durch die Kapillare bewegen, werden alle Zellen, die mit dem Fluorophor markiert sind, mit einem Laser aktiviert und angeregt.

Die Fluoreszenzintensität jeder angeregten Zelle wird dann von Vorwärts- und Seitenstreudetektoren gemessen und zur Analyse in einem Histogramm dargestellt. Neben der Quantifizierung können sowohl die Durchflusszytometrie als auch die Immunfluoreszenz verwendet werden, um Zellen zu Forschungszwecken in gereinigte Subpopulationen zu sortieren, und zwar mit einer Technik, die als fluoreszenzaktivierter Zellsortierer (FACS) bekannt ist.

• Odell, I. D., & Cook, D. (2013). Immunofluorescence Techniques. Journal of Investigative Dermatology 133. doi:10.1038/jid.2012.455.
• Parker, N., Schneegurt, M., Tu, A. T., et al. (2016). Kapitel 20.5. Fluorescent Antibody Techniques. In: Microbiology. Zugegriffen von https://openstax.org/books/microbiology/pages/20-5-fluorescent-antibody-techniques.
• Betterle, C., & Zanchetta, R. (2012). Die Immunfluoreszenztechniken in der Diagnose von endokrinen Autoimmunerkrankungen. Autoimmunity Highlights 3(2); 67-78. doi:10.1007/s13317-012-0034-3.

Weitere Lektüre

• Alle Antikörper-Inhalte
• VHH-Antikörper (Nanobodies) Vorteile und Grenzen
• Antikörperauswahl mit DNA-Origami-Gerüsten
• Verwendung von Histon-Deacetylase (HDAC)-Antikörpern in der Research
• Using Antibodies for Parkinson’s Disease Research

Written by

Benedette Cuffari

Nach dem Abschluss ihres Bachelor of Science in Toxikologie mit zwei Nebenfächern in Spanisch und Chemie im Jahr 2016, setzte Benedette ihr Studium fort und schloss im Mai 2018 ihren Master of Science in Toxikologie ab. Während ihres Studiums untersuchte Benedette die Dermatotoxizität von Mechlorethamin und Bendamustin, zwei Stickstoffsenf-Alkylierungsmittel, die in der Krebstherapie eingesetzt werden.

Zitate