Técnicas de anticuerpos fluorescentes

Por Benedette Cuffari, M.Sc.Revisado por Emily Henderson, B.Sc.

Desde su descubrimiento original en 1942, la tinción por inmunofluorescencia ha seguido siendo una técnica muy fiable y potente para una amplia gama de fines de investigación y diagnóstico.

Células de leucemia marcadas con moléculas fluorescentes. Crédito de la imagen: Vshivkova/.com

En general, las técnicas de anticuerpos fluorescentes (FA) implicarán el uso de células o de un anticuerpo, cuya región constante ha sido marcada con una etiqueta fluorescente conocida también como fluoróforo. Las técnicas de AF suelen clasificarse como directas o indirectas.

Anticuerpo de fluorescencia directa

La técnica de anticuerpos de fluorescencia directa, que también puede denominarse inmunofluorescencia directa (DIF), implica el uso de un único anticuerpo primario marcado con fluorescencia que se utiliza para unirse a un antígeno objetivo. Cuando se utiliza clínicamente, la IFD es especialmente útil para el diagnóstico rápido de enfermedades bacterianas como el Streptococcus pyogenes, que se conoce más comúnmente como estreptococo, así como la neumonía que es el resultado de las especies Mycoplasma pneumoniae y Legionella pneumophilia.

Para tales fines de diagnóstico, la muestra del paciente se coloca primero en un portaobjetos de microscopio y luego se expone al anticuerpo fluorescente. Cualquier unión entre el anticuerpo marcado con fluorescencia y el antígeno objetivo, que para estas situaciones serían las bacterias, hará que estas sustancias se iluminen al examinarlas con un microscopio de fluorescencia.

Además de su uso como herramienta de diagnóstico, la DIF también se utiliza ampliamente para estudios de investigación científica. Para ello, se coloca en un portaobjetos de vidrio una muestra de tejido congelada que se ha cortado en secciones finas de 5 o 6 micrómetros (µm).

Los portaobjetos se incuban entonces con un anticuerpo marcado con fluorescencia, que suele incluir un panel de anticuerpos dirigidos contra los isotipos de anticuerpos IgA, IgG e IgM junto con el complemento 3, que se dirige contra el antígeno de interés.

Tenga en cuenta que la concentración del anticuerpo utilizado para este tipo de estudio se basará en experimentos anteriores que hayan confirmado qué concentración puede lograr la mayor relación señal/fondo.

Después de incubar los portaobjetos durante al menos 30 minutos en la oscuridad y a temperatura ambiente, se lavan los portaobjetos y se obtienen imágenes con un microscopio de fluorescencia.

Image Credit: anyaivanova/.com

Anticuerpo de fluorescencia indirecta

En comparación con la técnica de un solo paso utilizada para la DIF, la IF indirecta (IIF) o FA indirecta (IFA) es un proceso de dos pasos que comienza con la aplicación de un anticuerpo primario no marcado sobre la muestra que se dirige contra un antígeno diana. El segundo paso de la IFI implica el uso de un anticuerpo secundario marcado con fluorescencia que se dirige contra la porción Fc del anticuerpo primario.

Aunque la IFI se considera más complicada que la DIF, ya que tarda más en completarse y requiere el uso de dos anticuerpos compatibles, es superior en términos de su capacidad de sensibilidad.

Algunas aplicaciones clínicas comunes de las pruebas de IFA incluyen las utilizadas para el diagnóstico de la sífilis. Para este tipo de prueba IFA, se aíslan células de T. palladium que han sido previamente aisladas de un animal de investigación y se colocan en la superficie de un portaobjetos de vidrio. A continuación, se extiende sobre las células de T. palladium un suero adquirido de un paciente para permitir que los anticuerpos antitreponémicos, si están presentes, se unan a los antígenos fijados.

Después de lavar la muestra de suero del paciente, se añade un anticuerpo secundario que ha sido marcado con un fluoróforo. Un resultado positivo de sífilis iluminará todos los complejos conjugados de anticuerpo secundario y fluoróforo.

Otro tipo de IFA que se utiliza ampliamente en entornos clínicos es el que se emplea para el diagnóstico del lupus eritematoso sistémico (LES). Los pacientes con LES, que es una enfermedad autoinmune, tendrán un mayor nivel de autoanticuerpos antinucleares (ANA) circulantes que se dirigen tanto al ADN como a varias proteínas que se unen al ADN.

Para este tipo de prueba de IFA, se cultivan células y se colocan en un portaobjetos de cristal. A continuación, cada portaobjetos se incuba con una concentración diferente del anticuerpo del paciente, que luego se lava para eliminar las proteínas no unidas.

Después del paso de lavado, se añade a los portaobjetos un anticuerpo secundario marcado con fluorescencia, que para la prueba de ANA será IgG antihumana, y se deja incubar. A continuación, se obtiene un título de ANA en el suero a partir de la mayor dilución de suero que haya mostrado fluorescencia y se utiliza para determinar un diagnóstico de LES.

Citometría de flujo

El tercer tipo de técnica de anticuerpos fluorescentes incluye la citometría de flujo, que es un sistema automatizado de recuento de células que puede utilizarse para cuantificar células específicas presentes en mezclas complejas como la sangre o el suero.

Un experimento típico de citometría de flujo comenzará con la incubación de un anticuerpo marcado con fluorescencia que está dirigido contra una subpoblación específica de células, como el anti-CD4, que puede unirse a la glicoproteína CD4 que se encuentra en la superficie de varias células inmunitarias, incluidas las células T helper, los monocitos y los macrófagos. La citometría de flujo también puede cuantificar la presencia de múltiples tipos de células mediante el uso de creadores de células adecuados.

Una vez finalizada la incubación, la muestra se introduce en el citómetro de flujo. Dentro de esta máquina, un capilar estrecho obliga a las células presentes en la muestra a moverse en una sola fila. A medida que las células se mueven a través del capilar, se utiliza un láser para activar y excitar cualquier célula que haya sido marcada con el fluoróforo.

La intensidad de fluorescencia de cada célula excitada se mide entonces mediante detectores de dispersión frontal y lateral y se representa en un histograma para su análisis. Aparte de los fines de cuantificación, tanto la citometría de flujo como la inmunofluorescencia pueden utilizarse para clasificar las células en subpoblaciones purificadas con fines de investigación mediante una técnica conocida como clasificador de células activado por fluorescencia (FACS).

• Odell, I. D., & Cook, D. (2013). Técnicas de inmunofluorescencia. Journal of Investigative Dermatology 133. doi:10.1038/jid.2012.455.
• Parker, N., Schneegurt, M., Tu, A. T., et al. (2016). Capítulo 20.5 Técnicas de anticuerpos fluorescentes. En: Microbiología. Accedido desde https://openstax.org/books/microbiology/pages/20-5-fluorescent-antibody-techniques.
• Betterle, C., & Zanchetta, R. (2012). Las técnicas de inmunofluorescencia en el diagnóstico de las enfermedades autoinmunes endocrinas. Autoimmunity Highlights 3(2); 67-78. doi:10.1007/s13317-012-0034-3.

Lectura adicional

• Todo el contenido de los anticuerpos
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Escrito por

Benedette Cuffari

Después de completar su Licenciatura en Toxicología con dos menores en español y química en 2016, Benedette continuó sus estudios para completar su Maestría en Ciencias en Toxicología en mayo de 2018. Durante la escuela de posgrado, Benedette investigó la dermatotoxicidad de la mecloretamina y la bendamustina; dos agentes alquilantes de mostaza de nitrógeno que se utilizan en la terapia contra el cáncer.

Citaciones