El número de copias de la metilación de la O6-metilguanina-ADN metiltransferasa (MGMT) se determina en relación con el número de copias de la beta-actina (ACTB) mediante la reacción en cadena de la polimerasa específica de metilación en tiempo real (MSP). Para ello, el contenido del tejido tumoral se enriquece mediante microdisección manual seguida de la extracción de ADN. El ADN se cuantifica utilizando Picogreen y se modifica mediante un tratamiento con bisulfito que hace que las citosinas no metiladas se conviertan en uracilo, mientras que las citosinas metiladas permanecen inalteradas. Posteriormente, se realiza una PCR específica de metilación (MSP) en tiempo real en el instrumento Quantstudio 5 para cuantificar el número de copias de MGMT y ACTB (1). Esta técnica consiste en realizar una PCR con detección en tiempo real utilizando el sistema de detección de amplifluores. Las muestras con un número de copias desconocido pueden cuantificarse mediante la comparación de sus valores Ct con los de una curva estándar de plásmidos.
Implicación clínica
MGMT es una enzima de reparación del ADN que se desactiva frecuentemente por hipermetilación en el cáncer humano. Cuando las células carecen de la actividad de MGMT, el daño en el ADN no se repara adecuadamente, lo que hace que el individuo sea más propenso al desarrollo de cáncer. Es interesante que esta falta de actividad de MGMT también hace que una célula tumoral sea más sensible a la radioterapia y a ciertos fármacos alquilantes como la temozolomida (2). En el estudio internacional de validación pronóstica de fase III (RTOG 0525), el ensayo MGMT identificó con éxito a los pacientes de glioblastoma recién diagnosticados que tienen más probabilidades de vivir más tiempo y de tener un periodo de tiempo libre de progresión más largo tras el tratamiento con temozolomida (3-5). Recientemente, se ha publicado una nueva publicación en la que tanto los pacientes metilados como los de la «zona gris» obtuvieron resultados significativamente mejores en cuanto a la supervivencia global que los pacientes realmente no metilados (6).
Requisitos del espécimen
Los especímenes aceptables para el ensayo son especímenes de tejido de glioma fijados en formalina e incluidos en parafina con un tiempo de fijación de 6-48 horas.
Volumen
Se prefiere un bloque de parafina representativo. Alternativamente, se aceptan 5 secciones de tejido sin teñir (1 portaobjetos de 5 µm de grosor para la tinción de H&E y un mínimo de 4 portaobjetos de 5-10 µm de grosor para la prueba de MGMT).
Instrucciones de almacenamiento y envío
Mantenga y envíe las muestras a temperatura ambiente.
Limitaciones
Para algunas muestras, se obtendrá un resultado no válido debido a un número insuficiente de copias de ACTB en combinación con un número de copias de MGMT inferior al límite de detección. La mayoría de las veces, esto se explica por una cantidad y/o calidad insuficiente de ADN. Para las muestras no válidas con un número de copias para MGMT y/o ACTB alrededor del LOD/LOQ y del límite de detección, se recomienda realizar una nueva prueba a partir del ADN tratado con bisulfito. Los fijadores distintos de la formalina o un tiempo de fijación prolongado pueden dar lugar a resultados inadecuados.
Requisitos especiales
Ninguno
Tiempo de respuesta
De cinco a siete días laborables para portaobjetos y bloques de parafina respectivamente.
- Vlassenbroeck I et al. Validation of Real-Time Methylation-Specific PCR to determine O6-Methylguanine-DNA Methyltransferase Gene Promotor Methylation in Glioma. J Mol Diagn. 2008 Jul;10(4):332-7
- Hegi ME et al. MGMT gene silencing and benefit from temozolomide in glioblastoma. N Engl J Med 2005 Mar 10;352(10):997-1003.
- Gilbert MR et al. Dose-dense temozolomide for newly diagnosed glioblastoma: a randomized phase III clinical trial.(7). J Clin Oncol. 2013 Nov 10;31(32):4085-91.
- Malmström A et al. Temozolomide versus standard 6-week radiotherapy versus hypofractionated radiotherapy in patients older than 60 years with glioblastoma: the Nordic randomised, phase 3 trial. Lancet Oncol 2012 Sep; 13(9): 916-926.
- Wick W et al. Quimioterapia con temozolomida sola versus radioterapia sola para el astrocitoma maligno en los ancianos: el ensayo aleatorio de fase 3 NOA-08. Lancet Oncol 2012 Jul; 13(7): 707-715.
- Hegi ME et al. MGMT Promoter Methylation Cutoff with Safety Margin for Selecting Glioblastoma Patients into Trials Omitting Temozolomide. Un análisis agrupado de cuatro ensayos clínicos. Clin Cancer Res 2019 Mar 15; 25(6): 1809-1816.
Actualizado el 23 de mayo de 2019