Materiales y métodos
Participantes
Los sujetos fueron 83 niños con TDAH (75% varones) y 72 niños con TD (51% varones), con edades comprendidas entre los 6 y los 13 años. Los criterios de inclusión para el grupo de TDAH fueron: (a) un diagnóstico clínico de TDAH según los criterios del DSM-IV, (b) confirmación de este diagnóstico mediante el Diagnostic Interview Schedule for Children, cuarta edición, administrado a los padres (DISC-IV-P; ), (c) síntomas significativos de TDAH, indicados por las puntuaciones de los padres >90º percentil en al menos una de las escalas de TDAH (escalas de Inatención e Hiperactividad/Impulsividad) de la Escala de Calificación de Trastornos del Comportamiento Disruptivo (DBDRS; ), y (d) síntomas generalizados de TDAH, indicados por las puntuaciones de los profesores >75º percentil en al menos una de las escalas de TDAH de la DBDRS. Tener un diagnóstico comórbido (por ejemplo, TDO o TEA) no fue un criterio de exclusión, como tampoco lo fue el tratamiento con medicación estimulante. Los niños que tomaban medicación estimulante (N = 50, el 60% del grupo de TDAH) suspendieron el uso de la droga 24 horas antes de la prueba, para permitir un lavado completo, y durante la participación en nuestro estudio. Los criterios de inclusión para el grupo de TD fueron (a) ausencia de un diagnóstico clínico de cualquier trastorno del desarrollo o de la conducta (incluidos el TDAH y el TOD), y (b) puntuaciones <90º percentil en las escalas de TDAH calificadas por los padres y por los profesores del DBDRS.
Materiales
Comportamiento.
Los padres de los niños elegibles para su inclusión en el grupo de TDAH fueron evaluados con la sección de trastorno de conducta disruptiva del DISC-IV-P. El DISC-IV-P es una entrevista diagnóstica estandarizada ampliamente utilizada para la evaluación de los trastornos psiquiátricos infantiles del DSM-IV, con propiedades psicométricas adecuadas.
Los padres y profesores de los niños tanto del grupo de TDAH como de TD completaron el DBDRS para evaluar los síntomas de TDAH y los síntomas de TOD y DC. El DBDRS contiene cuatro escalas que miden los síntomas de inatención, hiperactividad/impulsividad, TOD y DC en una escala de Likert de 4 puntos (que va de 0 a 3), donde las puntuaciones más altas indican peores síntomas. Se han reportado propiedades psicométricas adecuadas para la DBDRS.
La Escala de Calificación de Fortalezas y Debilidades del TDAH-Síntomas y Comportamiento Normal (SWAN; ) fue completada por padres y maestros para evaluar los síntomas del TDAH. Este cuestionario, ampliamente utilizado, contiene dos subescalas: la escala de inatención y la escala de hiperactividad/impulsividad, cada una de ellas compuesta por 9 ítems. Los ítems se puntúan en una escala Likert de 7 puntos (que va de -3 a +3), y las puntuaciones más altas indican peores síntomas. Los ítems se basan en los síntomas del TDAH del DSM-IV, pero reflejan ambos extremos (fuerte y débil) del comportamiento descrito en cada síntoma del TDAH. Las puntuaciones medias de ambas subescalas se utilizaron como variables dependientes. Se han reportado propiedades psicométricas adecuadas para el SWAN.
Los síntomas del TDAH se evaluaron utilizando la Escala de Respuesta Social (SRS; ) de 65 ítems, completada por padres y maestros. Los ítems de la SRS se basan en los dominios sintomáticos del DSM-IV del TEA, incluyendo el deterioro de la interacción social, los déficits comunicativos y los patrones de comportamiento o intereses restringidos/estereotípicos. El SRS utiliza una escala de Likert de 4 puntos (que va de 0 a 3), y la puntuación sumada de los ítems de la escala total del SRS se utilizó como medida dependiente, donde las puntuaciones más altas indican peores síntomas. El SRS tiene propiedades psicométricas adecuadas.
Manchas de sangre.
Para investigar las concentraciones sanguíneas de triptófano, tirosina y fenilalanina, se utilizó una técnica de manchas de sangre seca. La recogida de manchas de sangre es menos invasiva para los niños que la toma de muestras de sangre venosa y la técnica de manchas de sangre secas es suficientemente robusta y estable para fines de diagnóstico . Las concentraciones de AAA en las manchas de sangre están muy correlacionadas con las concentraciones de AAA en suero (rs de 0,86 a 0,96). Se recogió una mancha de sangre de cada niño utilizando una lanceta de seguridad desechable. Se colocaron tres gotas de sangre en una tarjeta de tinción de sangre. Se mezcló un punzón de 5,5 mm de una mancha de sangre seca con 100μl de una solución estándar interna (que contenía 29μM de L-fenilalanina-D5, 6μM de L-tirosina-D4 y 5μM de L-triptófano-D5) y 400μl de metanol en un vial de cromatografía de gases (GC-vial) y se agitó durante 15 minutos en un baño de ultrasonidos. El sobrenadante se transfirió a otro vial de CG y se evaporó bajo nitrógeno a 30°C. Posteriormente, la muestra se butiló con 100μl de cloruro de acetilo al 5,5% (en n-butanol) a 60°C durante 15 minutos. Después, la capa de butanol se evaporó bajo nitrógeno (a 30°C) y el residuo se disolvió en 500μl de acetonitrilo. Las concentraciones de triptófano, tirosina y fenilalanina en la mancha de sangre se determinaron mediante cromatografía líquida positiva-espectrometría de masas en tándem (LC-MS/MS), utilizando un espectrómetro de masas de triple cuadrupolo API 3000 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA), acoplado a un sistema de cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) (Perkin Elmer Series 200, Shelton, USA). Se inyectaron tres μl de la muestra en una columna C18 de simetría (3,9*150mm, 5μm; Waters, Milford, MA, EE.UU.) y se eluyeron con un flujo de 1ml/min de acetonitrilo al 75% (que contenía un 0,4% de ácido fórmico). El triptófano, la tirosina y la fenilalanina eluyeron en 1 minuto y se midieron utilizando las transiciones: relación masa-carga (m/z) 261,2→159,2 (triptófano), m/z 238,2→136,2 (tirosina) y m/z 222,2→120,2 (fenilalanina). Todos los datos LC-MS/MS obtenidos se adquirieron y procesaron utilizando el software Analyst 1.4.2 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Las concentraciones de las manchas de sangre de triptófano, tirosina y fenilalanina se expresaron en μmole/L. La fiabilidad de la LC-MS/MS se confirmó examinando la varianza inter-ensayo (siendo del 5-10%), la varianza intra-ensayo (siendo del 8-10%) y la recuperación (siendo del 90-112%).
Ingesta dietética de proteínas.
La ingesta diaria de proteínas se evaluó durante tres días, utilizando un diario nutricional informado por los padres. Se proporcionaron registros dietéticos estandarizados e instrucciones. Se instruyó a los padres para que registraran todos los alimentos y bebidas consumidos en el registro dietético y expresaran las cantidades consumidas con la mayor precisión posible. La cantidad de ingesta de proteínas (gramos/día) se calculó a partir de una versión informatizada de la base de datos holandesa de composición de alimentos . La base de datos holandesa de composición de alimentos contiene más de 2.000 productos alimenticios con información sobre la composición nutricional de los mismos. La base de datos se utiliza ampliamente con fines científicos (por ejemplo).
Urina.
Para examinar las concentraciones de AAA en la orina, los participantes recogieron toda la orina excretada en 18 horas consecutivas (después del horario escolar) en un recipiente de recogida de orina. Durante la recogida de orina, el recipiente se guardó en un refrigerador (<5°C). Se envió una muestra de 10 ml a un laboratorio para su análisis, donde la muestra se almacenó a -20°C. Se utilizó una técnica de HPLC con detección de fluorescencia para el análisis del triptófano en la orina . Las concentraciones de tirosina y fenilalanina en orina se determinaron con un analizador de aminoácidos Biochrom . Las concentraciones urinarias de triptófano, tirosina y fenilalanina se expresaron mediante una relación μmole/volumen total de orina, para descartar efectos de poliuria u oliguria. La fiabilidad de la técnica de HPLC se confirmó examinando la precisión de los análisis, siendo del 2,25% para el triptófano (desviación estándar relativa), y del 1,50% para la tirosina y la fenilalanina. Existen altas correlaciones entre las concentraciones de aminoácidos en las muestras de 12 horas y las de 24 horas , lo que indica que no hay variación diurna en la excreción de aminoácidos, validando el uso de una muestra de 18 horas en el presente estudio.
Procedimiento
Este estudio recibió la aprobación del comité ético médico local del Centro Médico de la Universidad VU de Ámsterdam, Países Bajos (#NL39922.029.12), y se ha realizado de acuerdo con las normas éticas establecidas en la Declaración de Helsinki de 1964 y sus modificaciones posteriores. Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de los padres de todos los niños, y de los niños ≥12 años, antes de la participación. Los niños con TDAH fueron reclutados en clínicas ambulatorias de salud mental, a través de la asociación de padres de niños con problemas de conducta, y a través de un sitio web de investigación de la universidad. El grupo de TD fue reclutado en escuelas primarias de todo el país. Los niños que tomaban medicación estimulante suspendieron el consumo de fármacos un día antes de la participación (día 0), para garantizar un lavado completo, y durante la evaluación de la ingesta de sangre, orina y alimentos (día 1 a día 3). El día 1 se recogió la mancha de sangre a primera hora de la mañana, para descartar los efectos de la variación diurna de las concentraciones de AAA en sangre. Ese mismo día, después del horario escolar, se inició la recogida de orina, que continuó durante las 18 horas siguientes, hasta que el niño volviera al colegio a la mañana siguiente (día 2). A primera hora de la mañana del día 1, los padres recibieron instrucciones detalladas sobre cómo rellenar el registro dietético y cómo recoger la orina de su hijo. Tras las instrucciones, los padres empezaron a registrar la ingesta dietética de sus hijos, lo que continuó durante los tres días siguientes (del día 1 al 3). Se invitó a los padres y profesores a rellenar los cuestionarios en un sitio web seguro. Todos los datos se recogieron entre febrero de 2013 y julio de 2014. El grupo de TDAH y TD fueron reclutados simultáneamente, para controlar los posibles efectos estacionales en la ingesta de alimentos o el metabolismo de AAA.
Análisis de datos
Todos los análisis estadísticos se realizaron utilizando R, versión 3.2.1. Todas las variables fueron inspeccionadas en cuanto a valores atípicos y faltantes para el grupo de TDAH y TD por separado. Se aplicó Winsorising a los valores atípicos, estos fueron sustituidos por un valor una unidad mayor (o menor) que la puntuación anterior más extrema en la distribución del grupo . Los datos que faltaban en las concentraciones urinarias, los datos dietéticos y los datos conductuales se distribuyeron aleatoriamente y se sustituyeron utilizando las medias de los grupos. En el caso de las manchas de sangre no hubo datos perdidos. Todos los datos se distribuyeron normalmente, excepto los síntomas de EC. Las diferencias de grupo en cuanto al género se examinaron mediante una prueba de chi-cuadrado, y las diferencias de grupo en cuanto a la edad y el funcionamiento conductual se examinaron mediante pruebas t de muestras independientes.
Para probar la primera hipótesis, las diferencias de grupo en las concentraciones de manchas de sangre de AAA se evaluaron mediante análisis de varianzas (ANOVA) con el grupo (TDAH o TD) como factor fijo. Los tamaños del efecto se calcularon en términos de eta cuadrada parcial, y se interpretaron como pequeños (> .01), medianos (> .06) o grandes (> .14) . Además, se calcularon las odds ratios, que expresaban el riesgo de ser diagnosticado de TDAH con concentraciones de AAA inferiores a la media. Los datos normativos para las concentraciones de AAA se obtuvieron de una amplia muestra de niños de 6 a 13 años (N = 104, 52% varones) (datos no publicados, información de la muestra y resultados disponibles de los autores). Para cada AAA, se utilizaron las concentraciones correspondientes al percentil 16 más bajo (M-1 SD) de la muestra normativa como valor umbral para definir las concentraciones de AAA por debajo de la media (para triptófano 45 μmole/L, tirosina 39 μmole/L y fenilalanina 47 μmole/L). Se calcularon las odds ratios con su intervalo de confianza del 95 % y se realizó la prueba exacta de Fisher para examinar la significación de las odds ratios.
Para probar la segunda hipótesis, los coeficientes de correlación producto-momento de Pearson investigaron la relación entre las concentraciones de AAA en las manchas de sangre y los síntomas de TDAH calificados por los padres y los profesores. La magnitud de los coeficientes de correlación se interpretó como pequeña (>.10), media (>.30) o grande (>.50) . Los datos del grupo de TDAH y del grupo de TD se combinaron para maximizar la variabilidad en las medidas de los síntomas de TDAH.
Para probar la tercera hipótesis, se realizaron análisis de correlación entre las concentraciones de AAA en manchas de sangre y la ingestión de proteínas y las concentraciones de AAA en la orina en toda la muestra. También se examinó si había diferencias de grupo en la ingestión de proteínas y las concentraciones de AAA en la orina utilizando ANOVAs con el grupo (TDAH o TD) como factor fijo. Por último, los análisis correlacionales evaluaron si las concentraciones de AAA en las manchas de sangre estaban relacionadas con los síntomas de trastornos psiquiátricos comórbidos declarados por los padres y los profesores (coeficientes de correlación producto-momento de Pearson para el TOD y el TEA, coeficientes de correlación de rango de Spearman para la EC). Si los síntomas de TDO, DC o TEA se encontraban relacionados con las concentraciones de AAA, se volvieron a realizar los análisis anteriores con estos síntomas introducidos como covariables. Para corregir las pruebas múltiples, el nivel alfa de los análisis de correlación se ajustó según el procedimiento de Bonferroni por dominio de resultado; síntomas de TDAH (12 análisis, por lo tanto p = .004), determinantes potenciales de las anormalidades de AAA en las manchas de sangre (12 análisis, por lo tanto p = .004), y síntomas de trastornos psiquiátricos comórbidos (18 análisis, por lo tanto p = .003). Se informan los resultados ajustados por Bonferroni.