Objetivos:

1. Diferenciar entre las dos principales categorías de bacterias: Gram positivas y Gram negativas.
2. Comprender cómo la reacción de tinción de Gram afecta a las bacterias Gram positivas y Gram negativas basándose en las diferencias bioquímicas y estructurales de sus paredes celulares.

Haga clic para ver la animación

La tinción es una técnica auxiliar empleada en las técnicas microscópicas que se utiliza para mejorar la claridad de la imagen microscópica.Las tinciones y los colorantes se utilizan ampliamente en el ámbito científico para resaltar la estructura de las muestras biológicas, las células, los tejidos, etc.

El procedimiento de tinción más utilizado en microbiología es la tinción de Gram, descubierta por el científico y médico danés Hans Christian Joachim Gram en 1884. La tinción de Gram es una técnica de tinción diferencial que diferencia las bacterias en dos grupos: grampositivos y gramnegativos. El procedimiento se basa en la capacidad de los microorganismos para retener el color de los tintes utilizados durante la reacción de tinción de Gram. Las bacterias gramnegativas son decoloradas por el alcohol, perdiendo el color de la tinción primaria, el púrpura. Las bacterias Gram-positivas no son decoloradas por el alcohol y permanecerán de color púrpura. Después del paso de decoloración, se utiliza una contratinción para impartir un color rosa a los organismos gramnegativos decolorados.

Fig: Hans Christian Joachim Gram

Importancia de una tinción de Gram:

La tinción de Gram es un paso preliminar muy importante en la caracterización y clasificación inicial de las bacterias. También es un procedimiento clave en la identificación de las bacterias en función de las características de la tinción, lo que permite examinar las bacterias con un microscopio de luz. Las bacterias presentes en un frotis no teñido son invisibles cuando se observan con un microscopio de luz. Una vez teñidas, también se puede observar la morfología y la disposición de las bacterias. Además, también es un paso importante en el cribado de agentes infecciosos en muestras clínicas, como los frotis directos de un paciente.

El procedimiento de tinción de Gram permite a las bacterias retener el color de las manchas, basándose en las diferencias en las propiedades químicas y físicas de la pared celular.

1. Bacterias positivas. Bacterias Gram positivas: Se tiñen de púrpura oscuro debido a que retienen el colorante primario llamado Violeta de Cristal en la pared celular.

Ejemplo: Staphylococcus aureus

Fig: Bacterias Gram positivas

2. Bacterias Gram negativas: Se tiñen de rojo o rosa debido a que retienen el colorante de contratinción llamado Safranin.

Ejemplo: Escherichia coli

Fig: Bacterias Gram negativas

Morfología bacteriana:

Las bacterias son microorganismos unicelulares muy pequeños y ubicuos en la naturaleza. Tienen un tamaño micrométrico (1µm = 10-6 m). Tienen paredes celulares compuestas de peptidoglicano y se reproducen por fisión binaria. Las bacterias varían en sus características morfológicas.

Las morfologías más comunes son:

Coccus (pleural: Cocci):

Bacterias esféricas; pueden presentarse en parejas (diplococos), en grupos de cuatro (tetracocos), en racimos tipo uva (estafilococos), en cadenas (estreptococos) o en disposiciones cúbicas de ocho o más (sarcinas).

Por ejemplo: Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes

Bacillus (pleural: Bacilli):

Bacterias con forma de vara; generalmente se presentan solas, pero ocasionalmente pueden encontrarse en parejas (diplobacilos) o en cadenas (estreptobacilos).

Por ejemplo: Bacillus cereus, Clostridium tetani

Spirillum (pleural: Spirilla):

Bacterias en forma de espiral

Por ejemplo: Spirillum, Vibrio, especies de espiroquetas.

Algunas bacterias tienen otras formas como:

Cocobacilos: Forma esférica u ovoide alargada.

Filamentosos: Bacilos que se presentan en largas cadenas o hilos.

Fusiformes: Bacilos con extremos cónicos.

Fig: Diferentes morfologías bacterianas

Mecanismo de tinción con gramo:

Pared celular positiva:

Las bacterias Gram positivas tienen una pared celular gruesa en forma de malla que se compone de peptidoglicano (50-90% de la pared celular), que se tiñe de color púrpura. El peptidoglicano es principalmente un polisacárido compuesto por dos subunidades llamadas N-acetil glucosamina y N-acetil ácido murámico. A medida que se van formando capas adyacentes de peptidoglicano, éstas se entrecruzan mediante cadenas cortas de péptidos por medio de una enzima transpeptidasa, lo que da lugar a la forma y rigidez de la pared celular. La gruesa capa de peptidoglicano de los organismos Gram-positivos permite a estos organismos retener el complejo cristal violeta-yodo y tiñe las células de color púrpura.

El ácido lipoteico (LTA) es otro de los principales componentes de la pared celular de las bacterias Gram-positivas que está incrustado en la capa de peptidoglicano. Está formado por ácidos teicoicos que son largas cadenas de fosfato de ribitol ancladas a la bicapa lipídica a través de un glicérido. Actúa como regulador de las enzimas autolíticas de la pared (muramidasas: Enzimas bacterianas localizadas en la pared celular que provocan la desintegración de la célula tras una lesión o muerte.)

Relevancia médica de la pared celular de los Gram positivos:

La LTA también tiene propiedades antigénicas que estimulan respuestas inmunitarias específicas cuando se libera de la pared celular tras la muerte de la célula. La muerte celular se debe mailnly a la lisis inducida por actividades lisozimales, péptidos catiónicos de los leucocitos o antibióticos betalactámicos.

Pared celular gramnegativa:

Las bacterias gramnegativas tienen una capa más fina de peptidoglicano (10% de la pared celular) y pierden el complejo cristal violeta-yodo durante la decoloración con el enjuague de alcohol, pero retienen la contratinción de Safranin, por lo que aparecen de color rojizo o rosa. También tienen una membrana externa adicional que contiene lípidos y que está separada de la pared celular mediante un espacio periplásmico.

Relevancia médica de la pared celular de los Gram negativos:

La pared celular de las bacterias Gram negativas suele ser un factor de virulencia que permite a las bacterias patógenas causar enfermedades. La virulencia de las bacterias Gram negativas se asocia a menudo con ciertos componentes de la pared celular, en particular, el lipopolisacárido (también conocido como LPS o endotoxina). En los seres humanos, el LPS provoca una respuesta inmunitaria innata caracterizada por la producción de citoquinas y la activación del sistema inmunitario. La inflamación se produce como resultado de la producción de citoquinas, que también pueden producir toxicidad en el huésped.

Reacción de la mancha:

Los cuatro pasos básicos de la tinción de Gram son:

1) Aplicación de la tinción primaria Violeta de Cristal (CV) a un frotis de cultivo bacteriano fijado en caliente.

El CV se disocia en soluciones acuosas en iones CV+ y Cl -. Estos dos iones penetran entonces a través de la pared celular y la membrana celular de las células tanto Gram-positivas como Gram-negativas. Los iones CV+ interactúan posteriormente con los componentes bacterianos cargados negativamente y tiñen las células bacterianas de color púrpura.

2) Adición de yodo de Gram.

El yodo (I – o I3 -) actúa como mordiente y como agente atrapante. Un mordiente es una sustancia que aumenta la afinidad de la pared celular por una tinción al unirse a la tinción primaria, formando así un complejo insoluble que queda atrapado en la pared celular. En la reacción de la tinción de Gram, el cristal violeta y el yodo forman un complejo insoluble (CV-I) que sirve para que el frotis adquiera un color morado oscuro. En esta fase, todas las células se volverán púrpuras.

3) Decoloración con alcohol etílico al 95%.

El alcohol o la acetona disuelven la membrana exterior lipídica de las bacterias Gram negativas, dejando así expuesta la capa de peptidoglicano y aumentando la porosidad de la pared celular. El complejo CV-I se desprende entonces de la fina capa de peptidoglicano, dejando incoloras a las bacterias Gram negativas.

Por otro lado, el alcohol tiene un efecto deshidratante en las paredes celulares de las bacterias Gram positivas que hace que los poros de la pared celular se reduzcan. El complejo CV-I se une fuertemente a la pared celular Gram positiva de múltiples capas y altamente reticulada, tiñendo así las células de color púrpura.

El paso de decoloración debe realizarse con cuidado, de lo contrario puede producirse una decoloración excesiva. Este paso es crítico y debe ser programado correctamente, de lo contrario, la tinción con violeta de cristal se eliminará de las células Gram positivas. Si el agente decolorante se aplica sobre la célula durante demasiado tiempo, los organismos Gram-positivos aparecerán como Gram-negativos. La infradecoloración se produce cuando el alcohol no se deja el tiempo suficiente para eliminar el complejo CV-I de las células Gram negativas, lo que hace que las bacterias Gram negativas aparezcan como Gram positivas.

4) Tinción de refuerzo con safranina

Las células Gram negativas decoloradas pueden hacerse visibles con una tinción de refuerzo adecuada, que suele ser safranina cargada positivamente, que las tiñe de rosa. El color rosado que se adhiere a las bacterias Gram positivas queda enmascarado por el púrpura del cristal violeta (a veces se utiliza la fuschina básica en lugar de la safranina en situaciones poco frecuentes).