Mecanismo de despolimerización sinérgica del extremo puntiagudo del filamento de actina por la proteína asociada a la ciclasa y la cofilina

Construcciones de ADN

Todas las proteínas N-CAP de ratón, N-CAP-GFP, la CAP1 completa, el dominio HFD, la fusión GST del dominio HFD y el dominio ADF-H C-terminal de la twinfilina, se clonaron en el vector de expresión bacteriana pSUMOck4 (un amable regalo de Inari Kursula, Universidad de Bergen, Noruega) para expresar una proteína de fusión etiquetada con SUMO que deja un N-terminal nativo después de la escisión con la proteasa SENP2. Para las construcciones de dominio CARP y C-CAP, utilizamos el vector de expresión bacteriana pCoofy18 (un amable regalo de Addgene). Para los detalles de las construcciones de proteínas y los cebadores utilizados para la clonación de las construcciones, véase la Tabla Suplementaria 2.

Expresión y purificación de las proteínas CAP y sus fragmentos

Todas las proteínas CAP de ratón y sus fragmentos, excepto la CAP1 de longitud completa, se expresaron a +22 °C en medio de autoinducción LB (AIMLB0210, Formedium) durante 24 h en BL21(DE3) E. coli (de Novagen).

La CAP1 de ratón de longitud completa se expresó en medio LB utilizando células E. coli ArcticExpress (DE3). En primer lugar, se inoculó un cultivo iniciador que contenía kanamicina (20 µg/ml) y gentamicina (20 µg/ml) que se incubó durante 6 h a +37 °C. Se inoculó el cultivo principal de 3,6 l, que sólo contenía kanamicina (20 µg/ml), y se hizo crecer hasta una DO600 de ~0,4 a +37 °C agitando a 240 rpm. La temperatura de cultivo se cambió a +13 °C durante 1 hora antes de la expresión de la proteína, que se indujo mediante la adición de 0,26 mM de IPTG durante 46 h. Todos los pellets bacterianos se recogieron por centrifugación, se resuspendieron en 50 mM de Tris-HCl, 150 mM de NaCl, 25 mM de imidazol, pH 7,5, se congelaron con N2 líquido y se almacenaron a -80 °C.

Todas las proteínas CAP y el dominio ADF-H de la twinfilina se purificaron utilizando un flujo de trabajo similar. En primer lugar, las bacterias se lisaron por sonicación en presencia de lisozima (0,5 mg/ml), DNAse (0,1 mg/ml) e inhibidores de la proteasa (200 µg/ml de PMSF, 1 µg/ml de leupeptina, 1 µg/ml de aprotinina, 1 µg/ml de pepstatina A; todos ellos de Sigma-Aldrich), y el lisado se aclaró por centrifugación. El sobrenadante se cargó en una columna HisTrap HP Ni-NTA (GE Healthcare) de 1 ml y se lavó ampliamente (>20 volúmenes de columna) con Tris-HCl 50 mM, NaCl 150 mM, imidazol 25 mM, pH 7,5. La proteína se eluyó con un gradiente de 25-250 mM de imidazol en la máquina AKTA Pure (GE Healthcare). Las fracciones máximas se agruparon y se añadió la proteasa SENP2 a una concentración final de 40 µg/ml para eliminar la etiqueta SUMO. La mezcla se dializó O/N a 4 °C utilizando tubos de diálisis SnakeSkin en 1 l de tampón 20 mM HEPES, 300 mM NaCl, 2 mM DTT, pH 7,4. Al día siguiente, las etiquetas SUMO escindidas se eliminaron con perlas de agarosa Ni-NTA (Qiagen) en los casos en que la etiqueta SUMO y la proteína escindida tenían el mismo tamaño. Las proteínas se concentraron con un filtro centrífugo Amicon Ultra-4 de 10 kDa (Merck) y se cargaron en una columna de filtración en gel HiLoad 16/600 Superdex 200 (GE Healthcare) equilibrada en 5 mM HEPES, 100 mM NaCl, 1 mM DTT, pH 7,4. Las fracciones máximas se recogieron, se concentraron y se congelaron mediante congelación rápida en N2 para su almacenamiento a -80 °C.

La CAP de longitud completa se purificó con las siguientes excepciones. Se utilizó una columna HisTrap HP Ni-NTA de 5 ml en lugar de una columna de 1 ml. Después de la diálisis y la filtración en gel con la columna de filtración en gel HiLoad 16/60 Superdex 200, las fracciones de los picos principales se pasaron por la columna de filtración en gel Superose 6 increase 10/300 GL para obtener una mejor separación de la mezcla de estados oligoméricos. Por último, se combinaron los picos principales de varias pasadas, se concentraron a intervalos de 5 minutos utilizando un filtro centrífugo Amicon Ultra-4 de 30 kDa y se almacenaron como se ha indicado anteriormente. Las proteínas CARP y C-CAP se purificaron como en el caso anterior con la excepción del uso de la proteasa 3C (0,01 mg/ml) para el corte de la etiqueta.

Otras proteínas

La actina muscular de conejo, las actinas etiquetadas, la profilina, la cofilina-1 de ratón, la proteína de tapado y la biotina-gelsolina se prepararon como se describe en la ref. 16. La actina ADP se preparó como se describe en la ref. 34. Brevemente, una solución de 30 µM de ATP-G-actina que contenía 0,3 mM de glucosa y 1 unidad/ml de hexocinasa (Sigma) se dializó contra el tampón de intercambio de nucleótidos (5 mM Tris-HCl, 0,1 mM MgCl2, 0,05 mM EGTA, 0,2 mM ADP, 1 mM DTT, pH 8,0) durante 4 h a 4 °C. Todos los experimentos se realizaron con α-actina de músculo de conejo.

Ensayos de despolimerización del extremo puntiagudo de actina

La medición de la tasa de despolimerización del extremo puntiagudo del filamento de actina se realizó utilizando un dispositivo de microfluidos emparejado a un montaje de microscopía, tal como se describe16. En resumen, preparamos una cámara con polidimetilsiloxano (PDMS, Sylgard), que se montó sobre un cubreobjetos limpio. Las cámaras microfluídicas tenían una altura de 20 µm. Las tres entradas y la salida estaban conectadas a tubos de presión controlada llenos de soluciones de diferente composición bioquímica (dispositivo de microfluidos Fluigent).

Después del montaje, las cámaras se enjuagaron con dH20 y tampón F (5 mM HEPES pH 7,4, 100 mM KCl, 1 mM MgCl2, 0,2 mM EGTA, 0,4 mM CaCl2, 0,2 mM ATP, 10 mM DTT y 1 mM DABCO). A continuación, la cámara se expuso sucesivamente a 150 µl de biotina-BSA al 0,1% en tampón F; 300 µl de BSA al 5%; 150 µl de 3 µg/ml de neutravidina en tampón F; y 10-100 µl de biotina-gelsolina 1-3 pM. Antes de los experimentos, se polimerizaron los filamentos de actina (8 µM, >30 min) en tampón F. Una fracción de monómeros de actina se marcó con Alexa-488 o 568. Los filamentos se inyectaron finalmente en la cámara y se anclaron al cubreobjetos mediante las gelsolinas hasta la densidad deseada.

Para medir la tasa de despolimerización de los extremos puntiagudos decorados con cofilina, los filamentos se saturaron primero con 2 µM de cofilina, y se expusieron a 2 µM de cofilina suplementada con diferentes proteínas CAP. La tasa de despolimerización se analizó con ImageJ, haciendo primero un quimógrafo para cada filamento (función reslice) y ajustando manualmente una pendiente a lo largo del extremo puntiagudo. Los filamentos cuyos extremos puntiagudos no podían ser claramente rastreados o tenían posibles pausas53 no observadas o eventos de corte fueron descartados del análisis.

Para minimizar el efecto de la etiqueta de la proteína en nuestras mediciones, utilizamos una fracción de etiquetado de actina del 10% o del 16% dependiendo de la configuración de la microscopía. No observamos efectos de la fracción de etiquetado para la actividad de N-CAP en nuestros experimentos. Todos los experimentos se llevaron a cabo a temperatura ambiente, en una configuración sin control de temperatura.

Reanudación de los filamentos de actina

Se mezclaron e incubaron soluciones de actina F en estado estacionario (en tampón F) con diferentes etiquetas fluorescentes para cuantificar la reanudación. La solución mezclada contenía 4 µM de Alexa568-actina (marcada al 10%) y 4 µM de Alexa488-actina (marcada al 10%), con o sin N-CAP y mutantes. Tras 4 minutos a temperatura ambiente, la solución de F-actina mezclada se diluyó 100× en tampón suplementado con metilcelulosa al 0,2%, y se introdujo en una cámara abierta hecha con cinta de doble cara intercalada entre dos cubreobjetos, y pasivada con BSA. Se adquirieron series de imágenes (con un intervalo de 2 s) en al menos tres campos de visión diferentes. Se contó el número de segmentos de F-actina de color verde (Alexa488), así como el número de estos segmentos que estaban conectados a un segmento de F-actina de color rojo (Alexa568), con el fin de determinar la relación de dos segmentos de color que se representa en la Fig. 2f. La monitorización de la difusión de los filamentos nos permitió determinar de forma inequívoca cuándo se conectaban dos segmentos. Los controles (sin N-CAP en la mezcla de F-actina) se repitieron varias veces, y los experimentos (con N-CAP o mutantes) al menos dos veces.

Ensayos de seccionamiento de actina

Para investigar el impacto de N-CAP en el seccionamiento por parte de la cofilina, utilizamos dos métodos diferentes, ya sea (1) midiendo la fracción de dominios individuales de cofilina que aún no han dado lugar a un seccionamiento o (2) cuantificando el número global de eventos de seccionamiento por µm de filamento de actina.

(1) Seccionamiento asociado a dominios individuales de cofilina (Supplementary Fig. 3c). Seguimos el procedimiento descrito anteriormente16. Brevemente, dentro de una cámara de microfluidos, se polimerizaron filamentos de actina marcados con Alexa-488 al 12% a partir de semillas de espectrina-actina, ancladas inespecíficamente a un cubreobjetos pasivado con BSA. Los filamentos se envejecieron durante 15 minutos con una solución de G-actina a una concentración crítica (100 nM de G-actina), de forma que los filamentos se convirtieran en >99% de ADP46. A continuación, los filamentos se expusieron continuamente a 500 nM de mCherry-cofilina-1 solo, con 2 µM de CAP1 de longitud completa o con 10 µM de N-CAP. En ImageJ, se construyeron entonces kimografías de los filamentos para seguir la nucleación y el ensamblaje de los dominios de cofilina individuales y los eventos de corte en la interfaz con los segmentos de actina desnudos.

Para cada dominio, se definió el tiempo 0 en el marco en el que se nuclearon. A continuación, registramos el momento en el que indujeron un evento de separación, o cuando se pierden debido a la separación por otro dominio, la fusión o el evento de censura. La fracción de dominios que no han inducido un evento de seccionamiento se calculó entonces utilizando un método clásico de Kaplan-Meier.

(2) Número total de eventos de seccionamiento/µm (Fig. Suplementaria 3d). Dentro de las cámaras de flujo (entre dos cubreobjetos espaciados por cinta de doble cara, primero inyectamos filamentos prepolimerizados marcados con Alexa-488 (en tampón F, con 0,2-0,3% de metilcelulosa). A continuación, se intercambió la solución con 500 nM de cofilina-1 no marcada y 0, 1 o 10 µM de NCAP. Después del intercambio, los filamentos que permanecieron cerca de la superficie se analizaron de la siguiente manera.

El número de eventos de corte por µm se calculó como la función acumulativa

donde Nsev(u) es el número de eventos de seccionamiento en el tiempo u, y \ {\mathop {\sum}\nolimits_i {{i(u)}} es la suma sobre todos los filamentos i de su longitud en el tiempo u. Como la solución no contiene G-actina, los filamentos se despolimerizan y, por tanto, la longitud de los filamentos disminuye con el tiempo.

Unión de N-CAP a los extremos puntiagudos de los filamentos

El experimento se realizó en cámaras de flujo (véase el ensayo de corte de actina (2)), pasivadas con biotina-PLL-PEG y funcionalizadas con neutravidina. La F-actina (10% Alexa-568, 1% biotina) se polimerizó durante la noche a 4 µM. Justo antes de la inyección en la cámara, la F-actina se diluyó hasta 200 nM y se mezcló con 100 nM de N-CAP-GFP, 2 µM de cofilina-1 y 4 nM de proteína de cobertura, en tampón F suplementado con metilcelulosa al 0,2%. Las imágenes de los filamentos de actina se adquirieron antes y después de una adquisición de flujo del canal GFP (5 cuadros/segundo durante 12 s, microscopía TIRF). Para el análisis de la unión a los extremos de los filamentos, se seleccionaron ciegamente los filamentos de actina que no se movieron durante la adquisición del flujo. La fluorescencia se midió en los dos extremos de cada filamento, en un área de 3 por 3 píxeles. Se detectó un evento de unión cuando la fluorescencia superaba un umbral arbitrario (el mismo valor para todos los filamentos y los extremos de los filamentos). Como la proteína de recubrimiento debería proteger el extremo puntiagudo, se atribuyó al extremo puntiagudo el mayor número de eventos de unión. La N-CAP-GFP se detectó en el 17% de los puntos de datos en el extremo puntiagudo del filamento, mientras que la asociación inespecífica de la N-CAP-GFP en las proximidades del extremo barbado del filamento se detectó en el 1,7% de los puntos de datos. A continuación, se calculó la fracción de supervivencia de N-CAP en el extremo puntiagudo y se ajustó con una exponencial única para medir la tasa de no unión.

Cristalización y determinación de la estructura

El dominio HFD de ratón se cristalizó con 10×His-tag presente, y se purificó como se ha descrito anteriormente, con la excepción de utilizar un tampón HEPES 5 mM, 50 mM NaCl, 0,2 mM DTT, 0,01% NaN3, pH 7,5 en la filtración en gel. La muestra se concentró a 7-10 mg/ml antes de la cristalización y se mezcló 1:1 con cacodilato de sodio 0,1 M, 12% PEG4000 (p/v), pH 6,1 en utilizando un método de gota sentada con un tamaño de gota de 200 nl en formato de 96 pocillos. Tras 2 semanas de incubación se observaron grandes cristales en forma de aguja. Para la recogida de datos a distancia en la Diamond Light Source (Reino Unido, Didgot) en la línea de luz I03, los cristales se crioprotegieron sumergiéndolos en un líquido madre que contenía un 25% de glicerol y se congelaron en N2 para enviarlos a la línea de luz. Los datos se recogieron a 100 K utilizando una longitud de onda de 0,9763 Å, un detector Pilatus3 6M, una potencia de transmisión del 30%, una exposición de 0,05 s y un ángulo de oscilación de 0,1° en un total de 2400 fotogramas. Los datos de difracción se integraron y escalaron con el software X-ray Detector (XDS)54. La solución inicial se obtuvo con reemplazo molecular utilizando PHASER55 y PDB = 1s0p como modelo de búsqueda. Se encontró una solución con cuatro dominios HFD presentes en una unidad asimétrica, tras lo cual múltiples rondas de refinamiento con BUSTER56 y la construcción manual en COOT57 produjeron un buen ajuste a los datos (ver Tabla 1). Se obtuvieron más mejoras al refinar los datos con la introducción de parámetros de traslación-liberación-tornillo (1/cadena), la eliminación de restricciones no cristalográficas y el modelado del factor B atómico individual. El Rwork/Rfree final para el modelo fue de 18,6%/23,0% con una buena geometría global.

Para la cristalización del complejo tripartito (de ADP-actina, dominio HFD de CAP1 de ratón, y dominio ADF-H C-terminal de twinfilin-1 de ratón), la ADP-actina se preparó en diálisis O/N a +4 °C en 5 mM HEPES, 0.2 mM MgCl2, 0,2 mM ADP, 0,2 mM EGTA, 0,3 mM glucosa, 0,5 mM β-mercaptoetanol, pH 8,0. La solución de actina, que contenía 0,3 mM de glucosa y 5 U/ml de hexocinasa, se transfirió a una membrana de diálisis Slide-A-Lyser y se colocó en un dispositivo de flotación a +4 °C. Al día siguiente, antes de la formación del complejo, se centrifugó la actina durante 20 minutos a 355.040 × g con el rotor TLA-120. Las proteínas se mezclaron en proporción 1:1.1:1.1 (actina, dominio HFD, dominio ADF-H), se concentraron a 10-20 mg/ml y se utilizaron para la cristalización como se ha indicado anteriormente. Se obtuvieron resultados de varias condiciones diferentes, y el mejor cristal difractante se obtuvo con una concentración de ~10 mg/ml del complejo mezclado 1:1 en HEPES 0,1 M, KCl 0,1 mM, PEG4000 10% (p/v), pH 7,0 con un tamaño de gota sentado de 200 nl. El primer día, aparecieron varios cristales pequeños en forma de diamante en la gota. Al tercer día, apareció un gran cristal en forma de varilla, mientras que todos los cristales pequeños se disolvieron. Para la recogida de datos a distancia en la Diamond Light Source (Reino Unido, Didgot) en la línea de luz I03, los cristales se crioprotegieron sumergiéndolos en LV CryoOil (MiTeGen) y se congelaron en N2 para su envío. Los datos se recogieron a 100 K utilizando una longitud de onda de 0,9762 Å, un detector Pilatus3 6M, una potencia de transmisión del 20%, una exposición de 0,05 s y un ángulo de oscilación de 0,15° en un total de 2400 fotogramas. Los datos de difracción fueron integrados y escalados con XDS54. Se obtuvo una solución inicial con sustitución molecular utilizando PHASER55 y PDB = 3daw como modelo de búsqueda que mostró una clara densidad extra en el extremo puntiagudo del monómero de actina. Así, se llevó a cabo otro reemplazo molecular y se obtuvo un modelo inicial para el complejo tripartito utilizando BALBES58 con 3daw y 1s0p como modelos de búsqueda. Se obtuvo una solución con Q = 0,787 y Rwork/Rfree = 29,7%/35,6%. La unidad asimétrica contenía un único complejo 1:1:1 de HFD:ADF-H:ADP-actina. Fueron necesarias múltiples rondas de refinamiento con BUSTER56 y la construcción manual en COOT57, especialmente la reconstrucción del bucle D y los bucles de conexión de las α-hélices en el dominio HFD para mejorar el modelo. Finalmente, la adición de aguas, la introducción de parámetros de traducción-libración-tornillo (1/cadena), y el modelado individual del factor B atómico dieron lugar a un modelo con un Rwork/Rfree final de 16,6%/19,4% con una buena geometría global.

Examen de las interacciones proteína-proteína por filtración en gel

Para estudiar la unión del monómero de actina, se preparó ADP-G-actina como se describe en la ref. 34. Todos los experimentos de filtración en gel se realizaron a +4 °C con una velocidad de funcionamiento de 0,5 ml/min y un fraccionamiento de 0,5 ml con una columna de filtración en gel Superdex 200 aumento 10/300 GL equilibrada en 5 mM HEPES, 100 mM NaCl, 0,1 mM ADP, 0,1 mM MgCl2, 1 mM DTT, pH 7,4. Se inyectaron cien microlitros de complejo que contenía 18 µM de dominio ADF-H de la twinfilina y 15 µM de otras proteínas en la columna y se analizó la elución. Las fracciones de los picos también se analizaron por SDS-PAGE. Los experimentos de competencia de monómeros de actina se realizaron como en el caso anterior, incluyendo 15 µM de dominio C-CAP o CARP a las muestras. Las fracciones de pico se analizaron en SDS-PAGE, se obtuvieron imágenes de los geles con el sistema de imágenes ChemiDoc XRS + (Bio-Rad) y se cuantificaron con Image Lab (Bio-Rad).

Native-PAGE

Los geles Mini-Protean TGX al 10% (Bio-Rad) se precargaron en tampón de funcionamiento enfriado (25 mM Tris, 195 mM glicina, 0,5 mM ADP, 0,1 mM MgCl2, pH 8,5) durante 1 hora antes de la carga. Las muestras se prepararon en tampón de diálisis ADP-actina (5 mM HEPES o Tris, 0,1 mM MgCl2, 0,1 mM EGTA, 0,2 mM ADP, 0,3 mM glucosa, 0,1 mM DTT, pH 8.0) a una concentración de 20 µM de cada proteína, mezclada en proporción 1:1 con el tampón de carga 2× (tampón de funcionamiento que contiene un 20% de glicerol, azul de bromofenol, sin ADP ni MgCl2) y, a continuación, aplicando un volumen de 5 µl a los pocillos de muestras de 50 µl. Los geles se ejecutaron a 100 V en hielo durante 4 h.

Asunto de desensamblaje de filamentos de actina fluorométrico

El desensamblaje en estado estacionario de los filamentos de ADP-actina se realizó como sigue: El 5% de pireno-actina se polimerizó en 20 mM de HEPES, 100 mM de NaCl, 1 mM de MgCl2, 1 mM de ATP, 1 mM de DTT, pH 7,4 durante 60 min. Los extremos de las púas de los filamentos se taparon con 50 nM de proteína de tapado. Posteriormente, se añadieron 0,5 µM de cofilina (y 0,5 µM de N-CAP), y la reacción se inició añadiendo 4 µM de proteína de unión a la vitamina D (agente secuestrador de monómeros). La concentración final de actina fue de 2,5 µM. El desmontaje de la actina se midió siguiendo la fluorescencia del pireno con excitación a 365 nm y emisión a 407 nm en un espectrofotómetro de fluorescencia (Agilent) durante 2400 s a 22 °C.

Espectrometría de CD

Los espectros de CD para el tipo salvaje de N-CAP, los mutantes y el dominio HFD se midieron a 20 °C con el espectropolarímetro J-720 (Jasco), en una cubeta de cuarzo de 300 µl de 0,1 cm de longitud de recorrido de la luz con los siguientes parámetros: modo de barrido continuo con velocidad de barrido de 50 nm/min, ancho de banda de 0,5 nm, rango de onda de 190-260 nm, paso de datos de 0,5 nm. Todas las proteínas se diluyeron a 15 µM con tampón PBS al 10%. La acumulación de diez escaneos para cada proteína se ha trazado como una única curva.

Modelos para simulaciones atomísticas de MD

Los modelos de actina decorada con cofilina se basaron en la estructura de microscopía crioelectrónica de 3,8 Å de resolución (PDBID: 5YU8)41. Los bucles que faltaban se construyeron utilizando RosettaCM59 y RosettaScripts60 en presencia del mapa de densidad electrónica41 imponiendo la simetría helicoidal asociada. Para ajustarse a las construcciones experimentales de este trabajo, las secuencias de actina y cofilina fueron, en esta etapa, cambiadas de las de pollo a las de conejo y ratón, respectivamente. Se generaron más de 1000 modelos. A continuación, se clasificaron en función de su puntuación total y se filtraron los que contenían artefactos estructurales (por ejemplo, enlaces peptídicos cis). Las simulaciones de dinámica molecular (MD) se iniciaron a partir de los tres modelos con mayor puntuación (Tabla Suplementaria 1, simulaciones F1-3).

El complejo HFD-actina se aisló del complejo cristalizado de dominio HFD/actina/dominio ADF-H de doblefilina y se acopló por separado a los modelos seleccionados de filamentos de actina decorados con cofilina descritos anteriormente. Para ello, se superpuso el HFD-actina aislado a cada monómero de actina de extremo puntiagudo, que luego se sustituyó por el HFD-actina. De este modo, la conformación de la estructura cristalina del dímero de actina-HFD se transfiere a la punta de la actina decorada con cofilina. Los modelos acoplados se refinaron primero localmente utilizando el protocolo de acoplamiento61 seguido de una relajación restringida con el protocolo fast relax62 distribuido con el paquete de software Rosetta. Este proceso se aplicó por separado para cada filamento de actina decorado con cofilina seleccionado para las simulaciones de MD (Tabla suplementaria 1, simulaciones C1-3).

Construcción del segmento del extremo puntiagudo para las simulaciones de MD

Cada simulación se realizó en un segmento del extremo puntiagudo del modelo de filamento de actina decorado con cofilina seleccionado, que se creó cortando el modelo perpendicularmente al eje del filamento. El plano del corte se eligió de forma que se incluyeran en el segmento cuatro monómeros enteros de actina unidos a ADP-Mg2+ y tres monómeros enteros de cofilina (Tabla suplementaria 1, simulaciones F1-3). El segmento también contenía los dos dominios HFD en el extremo puntiagudo en los sistemas unidos a HFD (Tabla Suplementaria 1, simulaciones C1-3). El segmento del extremo puntiagudo también contenía varios fragmentos polipeptídicos de cofilinas y actinas en su extremo puntiagudo (Supplementary Fig. 5a). Para mantener su conformación y posición durante las simulaciones, estas cadenas rotas se mantuvieron restringidas posicionalmente a lo largo de las simulaciones de la siguiente manera: Una capa de residuos en la interfaz con el resto del segmento del extremo puntiagudo se dejó libre; todos los átomos pesados cerca del plano de corte y sólo los átomos pesados de la columna vertebral para las regiones intermedias se restringieron con una constante de fuerza de 100 kJ/mol/nm2 (Supplementary Fig. 5a). Estos fragmentos polipeptídicos parcialmente restringidos en el extremo de las púas actúan como plataforma durante las simulaciones. Este enfoque mantiene tanto la interfaz proteína-proteína de tipo filamento en el extremo de púas como la orientación del filamento durante las simulaciones.

Los estados de protonación de los residuos se determinaron a pH neutro basándose en cálculos de pKa utilizando PROPKA363. Cada residuo H73 de actina fue metilado (Nτ-metil-l-histidina, HIC), y los N-terminales de actina, cofilina y HFD fueron acetilados. Las topologías para cada molécula de los sistemas se prepararon con el programa LeAP distribuido con ambertools1864, que luego se convirtieron al formato GROMACS utilizando la herramienta ParmEd.

Cada corte de extremo puntiagudo creado a partir de los modelos seleccionados se colocó en una caja de simulación de prisma hexagonal con su eje largo alineado con el eje z. Las dimensiones de la caja se eligieron para tener una distancia mínima de unos 17 Å entre el filamento y cada cara de la caja (Tabla suplementaria 1). Cada sistema se disolvió con una solución de NaCl 0,15 M con el número de iones ajustado para neutralizar el sistema.

Antes de las ejecuciones de producción, se realizó una minimización de descenso más pronunciado y sucesivas simulaciones de equilibrio cortas (en total ~7 ns) en los conjuntos NVT y NpT utilizando el termostato de Berendsen y el barostato65. Durante estas simulaciones de equilibrio se aplicaron restricciones posicionales armónicas a la rebanada final puntiaguda. Un grupo más pequeño de átomos (todos los átomos pesados, la columna vertebral de la proteína y, finalmente, sólo los átomos de Cα) fueron restringidos en cada simulación de equilibrio consecutiva con una constante de fuerza de 1000 kJ/mol/nm2.

Los sistemas que se ramificaron a partir de los otros (Tabla Suplementaria 1; C1′, C2′. F2′) se prepararon realizando la modificación adecuada (acoplando o eliminando los dominios HFD), eliminando las moléculas de disolvente que se solapaban (cuando se acoplaban los dominios HFD) y reajustando el tamaño de la caja y los átomos de disolvente para el nuevo tamaño del sistema. El equilibrio NVT y NpT por etapas con restricciones se realizó como se mencionó anteriormente (en total ~200 ps para las simulaciones donde se eliminaron los dominios HFD, y en total ~4 ns donde se acopla).

Todas las ejecuciones de producción se realizaron durante 1-2.5 μs en el conjunto NpT con sólo las restricciones posicionales mencionadas en la región de la plataforma.

Campos de fuerza y parámetros en las simulaciones MD

En las simulaciones MD se emplearon los siguientes campos de fuerza y conjuntos de parámetros: Amber ff14sb66 para las proteínas, el modelo TIP3P67 para el agua, el conjunto de parámetros de iones monovalentes de Joung y Cheatham68 para el Na+ y el Cl-, un modelo de iones multisitio octaédrico de Saxena y Sept69 para el Mg2+, y un conjunto de parámetros de compuestos polifosforilados de Meagher et al.70 para el ADP. Los parámetros de enlace perdidos para la metil-histidina (Nτ-metil-l-histidina, HIC) se adoptaron del campo de fuerza GAFF264. Las cargas atómicas se calcularon siguiendo el protocolo de Duan et al.71 Se empleó el software R.E.D.III.572 para el ajuste del potencial electrostático restringido multiconformación (RESP) utilizando una conformación extendida y otra α-helical del dipéptido HIC (Ace-HIC-Nme). Todos los cálculos químicos cuánticos se realizaron con el programa Gaussian0973 en el nivel teórico b3LYP/cc-pVTZ. Los cálculos de carga se realizaron con el modelo IEFPCM en un continuo polarizable con una constante dieléctrica de 4 estableciendo el disolvente como éter.

Protocolos de simulación MD

Todas las simulaciones se realizaron utilizando GROMACS 2018 74. Las ecuaciones de movimiento se integraron utilizando un algoritmo de salto de rana con un paso de tiempo de 2 fs. Todos los enlaces se restringieron utilizando el algoritmo LINCS75. Los protocolos de simulación se eligieron según la ref. 66. Las interacciones electrostáticas de largo alcance se trataron mediante el esquema de Ewald de malla de partículas lisas76 con un corte de espacio real de 0,8 nm, un espaciado de Fourier de 0,12 nm y una interpolación de cuarto orden. Se utilizó el potencial de Lennard-Jones con un corte de 0,8 nm para las interacciones de van der Waals. Se aplicaron correcciones de dispersión de largo alcance para la energía y la presión77.

Todas las simulaciones de producción se realizaron en el conjunto NpT. El trozo de extremo puntiagudo, la plataforma y el disolvente (agua y NaCl 0,15 M) se acoplaron a baños de temperatura separados a 310 °K utilizando el termostato Nosé-Hoover78,79 con una constante de tiempo de 1,0 ps. El acoplamiento de la presión isotrópica se realizó utilizando el barostato Parrinello-Rahman80 con una presión de referencia de 1 atm, una constante de tiempo de 5 ps y una compresibilidad de 4,5 × 10-5 bar-1.

Análisis de las simulaciones MD

Todos los análisis se realizaron utilizando VMD81 y scripts propios. Los cálculos MMGBSA se realizaron utilizando el software MMPBSA.py82 distribuido con ambertools1864 empleando el modelo GB modificado desarrollado por Onufriev et al.83 con una concentración de sal de 0,15 M (fotogramas muestreados cada 100 ns descartando los primeros 500 ns de cada simulación).

Análisis estructurales

Para el análisis de las diferentes estructuras de actina y sus estados conformacionales presentados en la Fig. 1d, se siguió el protocolo de Tanaka et al41,84 utilizando la estructura de actina F (PDB 6djo) como referencia.

Análisis estadístico y reproducibilidad

Los datos de las Figs. 2d, 4b y 4d se agruparon a partir de varios experimentos realizados en diferentes días, representando así los datos de varios experimentos independientes. Los paneles 2f, 2g, 2h y 3d presentan datos analizados de un único experimento representativo. n describe el número de filamentos analizados para los paneles 2d, 2f, 2g, 4b y 4d. n en el panel 6c corresponde al número de veces que se realizó el experimento.

Los experimentos de las Figs. suplementarias 2a-d, 3c, 6a-d se realizaron con resultados similares al menos dos veces. Los experimentos de la 3d, el experimento de competencia de dominios CARP de la 6a y los experimentos en condiciones de promoción del ensamblaje de la Fig. 7 se llevaron a cabo una vez.

Resumen de la información

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de la información de Nature Research vinculado a este artículo.