Más allá de la ecuación de Michaelis-Menten: Estimación precisa y eficiente de los parámetros cinéticos de las enzimas

Dos tipos de modelos que describen la cinética de las enzimas: Los modelos sQ y tQ

Una reacción enzimática fundamental consiste en una sola enzima y un solo sustrato, donde la enzima libre (E) se une reversiblemente con el sustrato (S) para formar el complejo (C), y el complejo se disocia irreversiblemente en el producto (P) y la enzima libre:

donde la concentración total de enzima (E T ≡ C + E) y la concentración total de sustrato y producto (S T ≡ S + C + P) se conservan. Un modelo popular que describe la acumulación del producto a lo largo del tiempo se basa en la ecuación de MM, como sigue (véase el Método Suplementario para la derivación detallada):

donde K M = (k b + k cat )/k f es la constante de Michaelis-Menten y k cat es la constante catalítica. Este modelo sQ derivado con el QSSA estándar ha sido ampliamente utilizado para estimar los parámetros cinéticos, K M y k cat a partir de la curva de progreso del producto8,9,10,11,23,25. Otro modelo que describe la acumulación del producto se deriva con el QSSA total; se desarrolló más tarde que el modelo sQ y, por tanto, ha recibido menos atención para la estimación de los parámetros26,27,28,29:

Aunque este modelo tQ es más complicado que el modelo sQ, es preciso en rangos más amplios que el modelo sQ. En concreto, el modelo sQ es preciso cuando

lo que requiere una baja concentración de enzimas7,14. Por otra parte, el modelo tQ es preciso cuando

donde K = k b /k f es la constante de disociación27,28,29. Es importante destacar que esta condición es generalmente válida y, por tanto, el modelo tQ, a diferencia del modelo sQ, es preciso incluso cuando la enzima está en exceso. Véase14,30 para más detalles.

A continuación, investigamos la precisión de las simulaciones estocásticas realizadas con ambos modelos. Específicamente, comparamos las simulaciones estocásticas usando el algoritmo de Gillespie basado en las funciones de propensión del modelo completo original (descrito en la Tabla S1), el modelo sQ (Tabla S2), o el modelo tQ (Tabla S3) para 9 condiciones diferentes31,32,33,34,35,36: E T es menor, similar o mayor que K M , y S T es también menor, similar o mayor que K M (Fig. 1). Las simulaciones estocásticas del modelo sQ no se aproximan a las del modelo completo original cuando E T no es bajo (es decir, E T no es inferior a S T ni a K M ). Por otro lado, las simulaciones estocásticas que utilizan el modelo tQ son precisas para todas las condiciones (Fig. 1), lo que concuerda con un estudio reciente que muestra que las simulaciones estocásticas con los modelos sQ y tQ son precisas cuando se cumplen sus condiciones de validez determinista (ecuaciones (3) y (4))37,38. En conjunto, el modelo tQ es válido para una gama más amplia de condiciones que el modelo sQ, tanto en sentido determinista como estocástico.

Mientras que el modelo sQ no consigue aproximarse al modelo completo original a medida que aumenta E T, el modelo tQ es preciso independientemente de E T . Las simulaciones estocásticas del modelo completo original (Tabla S1), el modelo sQ (Tabla S2), y el modelo tQ (Tabla S3) se realizaron con S T = 0,2, 2, o 80 nM, y E T = 0,2, 2, o 40 nM. Nótese que estas concentraciones son inferiores, similares o superiores a K M ≈ 2 nM. Aquí, las líneas y los rangos de color representan una trayectoria media y un rango de fluctuación (±2σ de la media) de 104 simulaciones estocásticas.

La estimación con el modelo tQ es insesgada para cualquier combinación de concentraciones de enzimas y sustratos

Debido a que el modelo tQ es preciso para un rango más amplio de condiciones que el modelo sQ (Fig. 1), planteamos la hipótesis de que la estimación de parámetros basada en el modelo tQ es también precisa para condiciones más generales. Para investigar esta hipótesis, primero generamos 102 curvas de progreso ruidosas de P a partir de las simulaciones estocásticas del modelo completo original (Fig. S1). A continuación, inferimos los parámetros (k cat y K M ) a partir de estos conjuntos de datos simulados aplicando la inferencia bayesiana con las funciones de verosimilitud basadas en el modelo sQ o en el tQ, bajo priores gamma débilmente informativos (Fig. S2) (ver Métodos para más detalles). Nótese que a lo largo de este estudio, hemos utilizado las curvas de progreso del producto simuladas (por ejemplo, la Fig. S1) porque necesitamos conocer los valores verdaderos de los parámetros para la comparación precisa de las estimaciones basadas en el modelo sQ y el modelo tQ.

Nos centramos primero en la estimación del gato k bajo el supuesto de que el valor de K M es conocido. Cuando E T es bajo, de modo que tanto el modelo sQ como el tQ son precisos (Fig. 1 izquierda), las muestras posteriores obtenidas con ambos modelos son similares y capturan con éxito el verdadero valor de k cat (Fig. 2a izquierda). Las muestras posteriores obtenidas con los dos modelos son similares porque, cuando E T es bajo y, por lo tanto, \({E}_{T}ll {S}_{T}+{K}_{M}\), ambos modelos (Ecuaciones 1 y 2) son aproximadamente equivalentes como sigue:

donde la primera aproximación proviene de la expansión de Taylor en términos de \({E}_{T}({S}_{T}-P)/({E}_{T}+{K}_{M}+{S}_{T}-P)\ll 1\) (véase27,28,29 para más detalles). Por lo tanto, cuando \({E}_{T}ll {S}_{T}+{K}{M}}) y por lo tanto el modelo sQ es preciso, las estimaciones con los modelos sQ y tQ deberían ser similares. Por otro lado, cuando E T es alto, muestran claras diferencias (Fig. 2a derecha): las muestras posteriores obtenidas con el modelo sQ muestran grandes errores, mientras que las obtenidas con el modelo tQ capturan con precisión el verdadero valor de k cat .

La estimación de un solo parámetro (k cat o K M ) con el modelo sQ o tQ. Para cada condición (S T = 0,2, 2, o 80 nM, y E T = 0,2, 2, o 40 nM), se obtuvieron 105 muestras posteriores de k cat (a) o K M (b) aplicando la inferencia bayesiana a 102 conjuntos de datos ruidosos (Fig. S1) (ver Métodos para más detalles). Cuando se muestrea el k cat, el K M se fija en su valor verdadero (a) y viceversa (b). Aquí, los triángulos verdes indican los valores verdaderos de los parámetros. Mientras que las estimaciones de k cat y K M obtenidas con el modelo sQ están sesgadas a medida que aumenta E T, las obtenidas con el modelo tQ tienen un sesgo insignificante independientemente de las condiciones (véase la Fig. S3 para los gráficos de caja de las estimaciones). A medida que aumenta E T o S T, la varianza posterior de K M aumenta cuando se utiliza el modelo tQ.

También se observan resultados similares en los gráficos de caja de las medias posteriores y los coeficientes de variación (CV) posteriores (Fig. S3a,b). Mientras que las medias posteriores obtenidas con el modelo sQ están sesgadas cuando E T es alto, las obtenidas con el modelo tQ son precisas para todas las condiciones (Fig. S3a). En particular, las estrechas distribuciones de las medias posteriores indican que la estimación de k cat con el modelo tQ es robusta frente al ruido de los datos (Fig. S1). Además, los CVs posteriores son mucho más pequeños que los CVs previos (Fig. S3b), indicando una estimación precisa de k cat con el modelo tQ.

A continuación, se estimó K M bajo el supuesto de que el valor de k cat es conocido (Fig. 2b). Las muestras posteriores del K M obtenidas con el modelo sQ vuelven a mostrar errores que crecen con el aumento de E T . Obsérvese que las estimaciones del K M están sesgadas al alza, lo que implica que utilizar las estimaciones posteriores del K M para validar la ecuación de MM (\({K}_{M}\gg {E}_{T}\)) puede ser engañoso. Por otro lado, las estimaciones de K M obtenidas con el modelo tQ están poco sesgadas para todas las condiciones. Sin embargo, a diferencia de las estrechas distribuciones posteriores de k cat (Fig. 2a), las de K M obtenidas con el modelo tQ se vuelven más amplias; por lo que la precisión disminuye a medida que aumenta E T o S T (Fig. 2b). Estos patrones también se observan en los gráficos de caja de las medias posteriores y los CV posteriores (Fig. S3c,d). El problema de identificabilidad surge porque, cuando \({E}_{T}gg {K}_{M}}) o \({S}_{T}gg {K}_{M}}) y, por tanto, \({E}_{T}+{S}_{T}gg {K}_{M}}), el K M es despreciable en el modelo tQ (Ec. 2), como sigue:

Específicamente, cuando K M es demasiado bajo, el valor de K M tiene poco efecto en la dinámica del modelo tQ y, por tanto, el K M es estructuralmente inidentificable. En conjunto, las estimaciones de K M con los modelos sQ y tQ no son satisfactorias, aunque por razones diferentes: las estimaciones con el modelo sQ pueden estar sesgadas y las del modelo tQ pueden ser estructuralmente inidentificables (Fig. 2b). También se observaron patrones similares cuando se dio una previa más informativa (Fig. S4). En particular, incluso con el prior informativo, las estimaciones obtenidas con el modelo sQ siguen mostrando un error considerable a medida que aumenta E T.

La estimación simultánea de k cat y K M adolece de falta de identificabilidad

A continuación, consideramos la estimación simultánea de dos parámetros, k cat y K M , que es el objetivo típico de la cinética enzimática. Para los mismos priores gamma utilizados en la estimación de un solo parámetro (Fig. 2), las distribuciones de las muestras posteriores obtenidas con ambos modelos se hicieron más amplias en general (Fig. 3). Para encontrar la razón de esta estimación imprecisa, analizamos los gráficos de dispersión de las muestras posteriores de k cat y K M (Fig. 4). Cuando \({S}_{T}\ll {K}_{M}) (Fig. 4a-c), las muestras posteriores de k cat y K M obtenidas con el modelo sQ exhibieron una fuerte correlación, porque la dinámica del modelo sQ depende sólo de la relación k cat /K M , como se ve en la siguiente aproximación:

donde se utiliza \({K}_{M}\gg {S}_{T}\ge {S}{T}-P\). Por otro lado, cuando \({S}_{T}\gg {K}_{M}\) (Fig. 4g-i), el gráfico de dispersión del modelo sQ se vuelve horizontal, lo que indica la no identificabilidad de la estructura de K M . De hecho, el valor de K M no tiene casi ningún efecto en la dinámica del modelo sQ, como se ve en la siguiente aproximación:

donde K M + S T ≈ S T se utiliza como \({S}_{T}\gg {K}_{M}\). Esta falta de identificabilidad de los parámetros cuando \({S}_{T}ll {K}_{M}\) o \({S}_{T}\gg {K}_{M}\) es coherente con estudios anteriores, que recomiendan utilizar S T ≈ K M para una estimación más precisa22,23. Sin embargo, incluso cuando S T ≈ K M , las estimaciones siguen siendo imprecisas (Fig. 3a y b centrales). Además, a medida que E T aumenta, las estimaciones obtenidas con el modelo sQ están sesgadas (Fig. 3) como en la estimación de un solo parámetro (Fig. 2). Basándose en este análisis, parece que la estimación simultánea de k cat y K M con el modelo sQ es un reto debido a los problemas de identificabilidad y de sesgo.

Estimación simultánea de dos parámetros (k cat y K M ) con el modelo sQ o tQ. A partir de los mismos 102 conjuntos de datos (Fig. S1) utilizados en la estimación de un solo parámetro (Fig. 2), se obtuvieron conjuntamente 105 muestras posteriores del k cat (a) y del K M (b). Aunque se da la misma prioridad, las distribuciones posteriores son más amplias que en la estimación de un solo parámetro (Fig. 2). Aquí, los triángulos verdes indican los valores verdaderos de k cat o K M .

Los gráficos de dispersión de las muestras posteriores obtenidas con la estimación de dos parámetros (Fig. 3). Los gráficos de dispersión implican dos tipos de inidentificabilidad de la estructura: una fuerte correlación entre k cat y K M , y la inidentificabilidad de K M , que se representa como un gráfico horizontal. Los gráficos de dispersión con correlación positiva del modelo tQ se convierten en horizontales cuando el K M muestreado es mucho menor que S T + E T (líneas grises discontinuas). Aquí, los triángulos verdes representan los verdaderos valores de los parámetros.

Cuando \({E}_{T}\gg {K}_{M}\) o \({S}_{T}\gg {K}_{M}\), el K M tiene un efecto insignificante en la dinámica del modelo tQ (Ecuación 6), y por lo tanto sólo k cat fue identificable en la estimación de un solo parámetro (Fig. 2a y b derecha o abajo). De forma similar, cuando tanto k cat como K M se infieren simultáneamente con el modelo tQ, la estimación de sólo k cat es exacta y precisa (Fig. 3a y b derecha o abajo), como se muestra en los gráficos de dispersión horizontal a lo largo del valor verdadero de k cat (Fig. 4c,f,g-i). En otros casos (cuando ni \({E}_{T}\gg {K}_{M}\) ni \({S}_{T}\gg {K}_{M}\)), la varianza posterior de ambos parámetros aumenta dramáticamente en comparación con la estimación de un solo parámetro (Figs 2 y 3 izquierda y arriba). Esta estimación imprecisa proviene de dos fuentes, según los gráficos de dispersión (Fig. 4a,b,d,e). Cuando k cat y K M disminuyen juntos, el comportamiento del modelo tQ cambia poco como el modelo SQ (Ec. 5), lo que lleva a la fuerte correlación entre las muestras posteriores de k cat y K M . A medida que las estimaciones de K M siguen disminuyendo junto con las de k cat , de modo que se vuelven mucho menos que E T + S T (línea vertical discontinua de la Fig. 4), el modelo tQ ya no depende del valor de K M , como se muestra en la Ec. 6, y por tanto los gráficos de dispersión se vuelven horizontales.

Los datos combinados de diferentes experimentos permiten una estimación exacta y precisa con el modelo tQ

Como se ha mostrado anteriormente, la estimación tanto de k cat como de K M utilizando una única curva de progreso sufre un sesgo considerable y una falta de identificabilidad (Figs 3 y 4), lo que concuerda con estudios anteriores que informan de que una curva de progreso obtenida de un único experimento no es suficiente para identificar ambos parámetros simultáneamente19. Por lo tanto, aquí investigamos si el uso de múltiples conjuntos de datos de curso temporal obtenidos bajo diferentes condiciones experimentales puede mejorar la estimación.

En los ensayos in vitro típicos, las curvas de progreso se miden con un S T fijo y un E T variado o un E T fijo y un S T variado 8,9,10,11,39. Primero consideramos el caso en que las curvas de progreso se miden con un S T fijo y un E T variado. En concreto, las curvas de progreso de E T baja y alta se utilizan para estimar los parámetros para un S T fijo en diferentes niveles (Fig. S1 superior e inferior). En este caso, las muestras posteriores obtenidas con el modelo sQ muestran errores considerables al utilizar los datos de E T alta (Figs 5a y S5). Por otro lado, las muestras posteriores obtenidas con el modelo tQ capturan con precisión los verdaderos valores tanto de k cat como de K M con una baja varianza (Figs 5a y S5). Esta mejora se debe a que los datos obtenidos con E T baja y alta proporcionan diferentes tipos de información para la estimación de los parámetros. Específicamente, a partir de los datos de alta E T, aunque el K M no es identificable, el k cat puede ser estimado con precisión con el modelo tQ (Fig. 4c,f,i). Esta estimación precisa de k cat a partir de los datos de alta E T puede evitar la correlación entre k cat y K M cuando se estiman a partir de los datos de baja E T (Fig. 4a,d). De hecho, los estrechos gráficos de dispersión del modelo tQ (Fig. 5b izquierda y centro) son la intersección de dos gráficos de dispersión, uno horizontal obtenido con los datos de E T alta (Fig. 4c,f) y otro no horizontal obtenido con los datos de E T baja (Fig. 4a,d). Sin embargo, cuando S T es alto, el gráfico de dispersión de los datos de E T baja también se vuelve horizontal (Fig. 4c), y por lo tanto el efecto sinérgico de usar datos combinados disminuye (Fig. 5a,b derecha). En conjunto, el modelo tQ puede estimar con precisión ambos parámetros a partir de la combinación de datos de E T baja y E T alta cuando S T no es mucho mayor que K M . Tenga en cuenta que se prefiere un S T tan bajo para los experimentos in vitro24,39,40,41 y es el caso de la mayoría de las condiciones fisiológicas24.

Cuando se utilizan conjuntamente los datos obtenidos bajo un E T bajo y un E T alto, la exactitud y la precisión de las estimaciones obtenidas con el modelo tQ, pero no con el modelo sQ, mejoran. (a) Las muestras posteriores se infieren utilizando conjuntos de datos de E T = 0,2 nM (Fig. S1 superior) y E T = 40 nM (Fig. S1 inferior) juntos para S T = 0,2, 2 u 80 nM. La varianza posterior del modelo tQ disminuye drásticamente hasta el nivel de la estimación de un solo parámetro (Fig. 2). Sin embargo, las estimaciones del modelo sQ muestran un sesgo considerable. Aquí, los triángulos verdes representan los verdaderos valores de k cat o K M . (b) Los gráficos de dispersión de las muestras posteriores. Aquí los triángulos verdes, los círculos azules y los cuadrados rojos representan los valores verdaderos, las medias posteriores del modelo sQ y las del modelo tQ, respectivamente.

A continuación, consideramos el caso en el que las curvas de progreso se miden con un E T fijo y un S T variado. Específicamente, la combinación de dos curvas de progreso de S T bajo y alto se utiliza para inferir los parámetros para un E T fijo en diferentes niveles (Fig. S1 izquierda y derecha). Cuando E T es bajo, y por tanto los modelos sQ y tQ se comportan de forma similar (Ec. 5), las muestras posteriores obtenidas con ambos modelos capturan con precisión los verdaderos valores de k cat y K M (Figs 6a izquierda y S6). De nuevo, el gráfico de dispersión estrecho (Fig. 6b izquierda) se obtiene como la intersección de un gráfico de dispersión no horizontal de S T bajo (Fig. 4a) y un gráfico de dispersión horizontal de S T alto (Fig. 4g). Sin embargo, a medida que E T aumenta, y por tanto el modelo sQ se vuelve menos preciso, los obtenidos con el modelo sQ están sesgados, como era de esperar (Figs 6a derecha y S6). Mientras que tales sesgos no se observan en los obtenidos con el modelo tQ, la precisión de las estimaciones de K M disminuye a medida que aumenta E T, como en la estimación de un solo parámetro (Fig. 2 y Ec. 6).

Estimación utilizando los datos obtenidos bajo S T bajo y S T alto conjuntamente. (a) Las muestras posteriores se infieren utilizando conjuntos de datos de S T = 0,2 nM (Fig. S1 izquierda) y S T = 80 nM (Fig. S1 derecha) juntos para E T = 0,2, 2, o 40 nM. Cuando E T es bajo, tanto el modelo sQ como el tQ permiten una estimación exacta y precisa. A medida que E T aumenta, las estimaciones obtenidas con el modelo sQ se vuelven inexactas, y las estimaciones de K M obtenidas con el modelo tQ se vuelven menos precisas, de forma similar a la estimación de un solo parámetro (Fig. 2). Aquí, los triángulos verdes representan los verdaderos valores de k cat o K M . (b) Los gráficos de dispersión de las muestras posteriores. Aquí los triángulos verdes, los círculos azules y los cuadrados rojos representan los valores verdaderos, las medias posteriores del modelo sQ y las del modelo tQ, respectivamente.

Diseño óptimo de experimentos para una estimación precisa y eficiente con el modelo tQ

Cuando se utiliza una curva de progreso obtenida de un solo experimento, los gráficos de dispersión posterior del modelo tQ pueden clasificarse como de tipo correlativo (Fig. 4a,b,d,e) y de tipo horizontal (Fig. 4c,f,g-i). Las intersecciones de estos dos tipos diferentes de gráficos de dispersión tienden a estar estrechamente distribuidas cerca del valor verdadero (Figs 5b y 6b). Así, la combinación de dos de estos conjuntos de datos permite una estimación precisa tanto de k cat como de K M (Figs 5a y 6a). Específicamente, una curva de progreso medida bajo \({E}_{T}\ll {K}_{M}\) y \({S}_{T}\ll {K}_{M}\) (Fig. 4a,b,d,e) y una medida bajo \({E}_{T}\gg {K}_{M}\) o \({S}_{T}\gg {K}_{M}\) (Fig. 4c,f,g-i) proporcionan diferentes tipos de información para la estimación de los parámetros, por lo que el uso de ambos conjuntos de datos conduce a una estimación exitosa. Sin embargo, es difícil comparar los valores de S T , E T , y K M en la práctica, porque el valor de K M suele ser desconocido a priori. Este problema puede resolverse fácilmente utilizando el gráfico de dispersión. Es decir, si el gráfico de dispersión posterior obtenido del primer experimento es horizontal, entonces tanto E T como S T deben disminuirse para el siguiente experimento, de modo que se pueda obtener el gráfico de dispersión no horizontal (Fig. 7a). Por otro lado, si el diagrama de dispersión del primer experimento muestra una fuerte correlación entre K M y k cat , entonces S T o E T deben aumentarse en el siguiente experimento (Fig. 7b). Básicamente, sin ninguna información previa del valor de K M y k cat , la forma de los gráficos de dispersión de las estimaciones actuales determina el siguiente diseño experimental óptimo, lo que garantiza una estimación exacta y precisa. Sin embargo, este enfoque no puede utilizarse con el modelo sQ, porque la estimación con el modelo sQ puede estar sesgada, dependiendo de la relación entre E T o S T y K M , que se desconoce a priori. Es decir, a diferencia del modelo tQ, la estimación precisa no siempre garantiza una estimación exacta con el modelo sQ, como se ha visto anteriormente (por ejemplo, la Fig. 5a derecha).

El diseño experimental óptimo para una estimación exacta y precisa con el modelo tQ. (a) Cuando el gráfico de dispersión de las muestras posteriores del primer experimento es horizontal, es necesario disminuir E T y S T para obtener el gráfico de dispersión no horizontal en el siguiente experimento. Entonces, el uso de la combinación de los dos experimentos conduce a una estimación exacta y precisa (gráficos de dispersión rojos). (b) Cuando el diagrama de dispersión del primer experimento no es horizontal, es necesario aumentar E T o S T en el siguiente experimento para obtener un diagrama de dispersión horizontal. (c) La inferencia con una sola curva de progreso a partir de la E T baja (0,1 K M ) y la E T alta (10 K M ) conduce a gráficos de dispersión no horizontales y horizontales, respectivamente, para la quimotripsina, la ureasa y la fumarasa (gráficos de dispersión grises). Cuando se utilizaron ambos conjuntos de datos juntos, se obtuvieron estimaciones precisas para todas las enzimas (gráficos de dispersión rojos). Aquí se utiliza un S T bajo (0,1 K M ). Aquí, los triángulos verdes representan los valores verdaderos de los parámetros.

Probamos si el enfoque propuesto con el modelo tQ puede estimar con precisión k cat y K M para la catálisis del éster etílico de la N-acetilglicina, el fumarato y la urea por las enzimas la quimotripsina, la ureasa y la fumarasa, respectivamente (Fig. 7c). Estas tres enzimas fueron elegidas porque tienen eficiencias catalíticas dispares (k cat /K M )1: 0,12, 4 – 105, y 1,6 – 108 s -1 M -1, respectivamente. Para cada enzima, se generaron 102 conjuntos de datos de curso temporal ruidoso utilizando simulaciones estocásticas basadas en parámetros cinéticos enzimáticos conocidos1. Cuando se utilizan curvas de progreso obtenidas con E T y S T bajas, como se esperaba, se obtuvieron gráficos de dispersión no horizontales de muestras posteriores para las tres enzimas (Fig. 7c). Esto indica que se debe aumentar E T o S T en el siguiente experimento para obtener un gráfico de dispersión horizontal. De hecho, cuando se utilizó una curva de progreso con un aumento de 100 veces de E T, se obtuvieron gráficos de dispersión horizontales para todas las enzimas (Fig. 7c). Por lo tanto, cuando estas dos curvas de progreso se utilizan conjuntamente, tanto k cat como K M pueden estimarse con precisión (Fig. 7c puntos rojos). Estos resultados apoyan que este diseño experimental optimizado en dos pasos (Fig. 7a,b) para obtener dos tipos diferentes de gráficos de dispersión permite una estimación precisa y eficiente de la cinética enzimática con el modelo tQ. Se proporciona el paquete computacional que realiza dicha estimación (véase el Método para los detalles).