Las cepas de Streptococcus pyogenes procedentes de infecciones invasivas graves se unen a las células HEp2 y HaCaT con más avidez que las cepas de infecciones no complicadas

Streptococcus pyogenes (estreptococo del grupo A ) es un agente etiológico de diversas enfermedades humanas, incluyendo faringitis, pioderma y enfermedades invasivas graves. Además, el patógeno está asociado a secuelas potencialmente mortales como la glomerulonefritis postestreptocócica y la fiebre reumática aguda. En el Territorio del Norte (TN) de Australia, la incidencia de la fiebre reumática aguda es muy alta entre la población indígena (3), a pesar de la baja tasa de aislamiento de GAS en la garganta. Además, la pioderma por infección por SGA es extremadamente común y la glomerulonefritis postestreptocócica es endémica en muchas comunidades aborígenes remotas (4, 7). Mientras que la portación asintomática en la garganta suele ser el reservorio de las cepas asociadas a la enfermedad invasiva (5), en las poblaciones donde el impétigo es endémico, como en las comunidades aborígenes del TN, el principal reservorio es la piel. Independientemente de cuál sea el tejido primario de la infección, lo primero que necesita el patógeno es adherirse a las células del huésped. El genoma de S. pyogenes codifica numerosos genes que podrían considerarse como codificadores de adhesinas. Estos genes están muy regulados y las cepas individuales no tienen el potencial genético para codificar todas estas proteínas. Las adhesinas incluyen la proteína M (una molécula antifagocítica), la cápsula y las proteínas de unión a la fibronectina. Hay muchas proteínas de unión a la fibronectina diferentes, como SfbI (8, 12), PrtF2 (9, 10), Fbp54 (2) y SfbII (11). La capacidad de adherencia de una cepa individual podría variar en función del repertorio de genes para las adhesinas que posee la cepa y su nivel de expresión. Esto, a su vez, podría reflejar las diferencias en la capacidad de colonizar e infectar de forma persistente diferentes lugares de los tejidos. Un corolario de esto es que los aislados de diferentes sitios tisulares pueden mostrar diferencias en la capacidad de adherencia. Para comprobarlo, hemos determinado el grado de adhesión de los aislados de SGA de la piel, la garganta y la sangre a las líneas celulares HEp2 y HaCaT, que representan las células epiteliales de la laringe y los queratinocitos humanos, respectivamente.

Los aislados de SGA del TN se recogieron entre 1990 y 2002. Las 72 cepas analizadas en este estudio se aislaron de sangre (n = 26), piel (n = 22) y garganta (n = 24) (Tabla 1). Las cepas aisladas en sangre procedían de enfermedades graves, y las restantes, de infecciones no complicadas. Los aislados se tipificaron como virus según lo descrito anteriormente (6). La tipificación del virus implica el polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción del regulón mga, que incluye el gen de la proteína M altamente variable. Para garantizar la inclusión de cepas no relacionadas epidemiológicamente, se incluyó un aislado representativo de cada tipo de Vir. Los cultivos se hicieron crecer durante la noche a 37°C en un agitador orbital hasta la fase estacionaria en caldo Todd-Hewitt (Oxoid, Basingstoke, Reino Unido) suplementado con 1% de extracto de levadura. Para preparar el inóculo de GAS para los ensayos de adherencia, se centrifugaron los cultivos de la noche a la mañana y los pellets se lavaron en solución salina tamponada con fosfato (PBS; Life Technologies Gibco BRL, Nueva York, N.Y.) y se resuspendieron en medio RPMI 1640 sin suero ni antibióticos (Life Technologies) hasta alcanzar una densidad óptica a 600 nm de 0,05. Esto representa aproximadamente entre 1 × 107 y 1,5 × 107 bacterias por ml.

Las células epiteliales laríngeas humanas (HEp2) se mantuvieron en medio RPMI 1640 suplementado con 10% de suero fetal de ternera (Life Technologies), 1% de Fungizone (Life Technologies), 20 μg de vancomicina HCl (David Bull Laboratories, Sydney, Australia) por ml, y 100 μg de sulfato de estreptomicina (Sigma, St. Louis, Mo.) por ml. Los queratinocitos de piel humana adulta (células HaCaT) se mantuvieron en medio Eagle modificado de Dulbecco (Life Technologies) complementado con un 10% de suero fetal de ternera inactivado por calor. Para los ensayos de adherencia, se sembraron ∼105 células/ml en cubreobjetos de vidrio de 12 mm de diámetro en el fondo de placas de cultivo de tejidos de 24 pocillos (Nunc, Roskilde, Dinamarca). Tras una noche de crecimiento a 37°C en una atmósfera de CO2 al 5%, las células se lavaron con PBS (pH 7,4) y se inocularon con 500 μl del inóculo de GAS. Tras 2 h de incubación a 37°C, se lavaron los cubreobjetos cinco veces añadiendo 1 ml de PBS a cada pocillo y, tras mezclar suavemente, se eliminó la solución de lavado por aspiración. Una vez eliminadas las bacterias no adherentes, las células huésped y las bacterias adherentes se fijaron con metanol al 95% y se secaron al aire. Tras la fijación por calor, los cubreobjetos se colocaron en portaobjetos y se tiñeron de Gram para su visualización bajo inmersión en aceite. En cada experimento, se analizaron las células de varios campos al azar, y la adhesión se expresó como el número medio de cadenas GAS por célula. Todos los ensayos se realizaron por duplicado y se determinó la media de unión para cada cepa. Todos los análisis estadísticos se realizaron con el programa Stata Statistics/Data Analysis versión 7.0 (Stata Corporation, College Station, Tex.). Los datos se analizaron con pruebas t.

Las cepas de GAS se adhirieron a ambos tipos de células, y el grado de unión varió de una cepa a otra (Tabla 1). Hubo una buena correlación entre experimentos independientes con 20 cepas repetidas en dos intervalos de tiempo (datos no mostrados), lo que sugiere que la avidez de la unión es reproducible y específica de la cepa. En general, la unión del GAS a las células HaCaT es mayor que a las células HEp2 (P < 0,05). Cuando los datos de la Tabla 1 se separaron en función del lugar de aislamiento del tejido, una media de 270 cadenas de cepas de SGA procedentes de la sangre se unieron a 50 células HaCaT (Fig. 1). Por el contrario, las cepas de la piel y la garganta se unieron en promedio sólo a 169 y 178 cadenas por 50 células HaCaT, respectivamente. Estas diferencias son estadísticamente significativas (P = 0,0044 y 0,0063, respectivamente). Curiosamente, para las células HEp2 las diferencias son menos pronunciadas y no son estadísticamente significativas. Sin embargo, cuando se volvieron a analizar los datos en función de las infecciones invasivas frente a las no complicadas combinando los datos de los aislados de la piel y la garganta, se encontraron diferencias significativas entre las dos categorías en ambas líneas celulares (P = 0,0011 para HaCaT; P = 0,0238 para HEp2).

Trabajos anteriores de este laboratorio demostraron que muchas cepas de S. pyogenes que circulan comúnmente podían causar enfermedad invasiva con la piel como sitio principal de infección (1). Estas observaciones son coherentes con los presentes hallazgos de una mayor avidez de las cepas de NT GAS por las líneas celulares HaCaT que por las HEp2 y de que los aislados de sangre pueden adherirse en mayor número que los aislados de infecciones no complicadas. Entre las posibles explicaciones de la elevada propensión a la adherencia de los aislados sanguíneos de S. pyogenes se incluyen las diferencias tanto genotípicas como fenotípicas entre los aislados procedentes de fuentes de enfermedad invasivas y no invasivas. Se requieren más estudios para definir la naturaleza de esta avidez de adhesión y para determinar si es consistente dentro de las poblaciones clonales.