La reducción in vivo de RyR1 en el músculo desencadena una miopatía similar al núcleo

Generación del modelo de ratón RyR1Flox/Flox::HSA-Cre-ERT2

Una línea de ratón con sitios loxP insertados a ambos lados de los exones 9-11 del gen RYR1 (denominada RyR1Flox/Flox) fue apareada con la línea de ratón HSA-Cre-ERT2 que expresa la recombinasa Cre-ERT2 dependiente de tamoxifeno bajo el control del gen de la α-actina del músculo esquelético humano, para crear RyR1Flox/Flox::HSA-Cre-ERT2. La inyección de tamoxifeno induce la activación de la recombinasa Cre-ERT2 de forma selectiva en el músculo esquelético, lo que provoca la deleción de los exones 9-11 y la interrupción del gen RYR1 en el músculo esquelético con una estricta dependencia del tamoxifeno (Fig. 1a). Al nacer, los ratones RyR1Flox/Flox::HSA-Cre-ERT2 eran normales, y a los 2 meses de edad, una vez adultos jóvenes, se indujo la recombinación mediante la inyección de tamoxifeno (a partir de este momento, los animales recombinados se denominaron RyR1-Rec). Se siguieron estudiando las consecuencias moleculares y fisiológicas en función del tiempo, hasta 105 días después de la inducción de la recombinación (Fig. 1b). Los animales de control (CTRL) son compañeros de camada RyR1Flox/Flox (sin el transgén HSA-Cre-ERT2) inyectados con tamoxifeno. El fenotipo general de los ratones recombinados a los 75 días se caracteriza por una cifosis asociada a una movilidad anormal de las extremidades traseras y una marcha de pato. Los animales todavía son capaces de ponerse de pie sobre sus patas traseras para alimentarse, pero los gránulos de comida se han administrado sistemáticamente directamente en la jaula a medida que avanzaba la enfermedad. A los 105 días, los animales siguen moviéndose en sus jaulas y no se ha observado un aumento de la tasa de mortalidad en comparación con CTRL. Tanto los machos como las hembras estaban afectados. La cantidad relativa de RyR1 a nivel de ARNm se analizó en el músculo del cuádriceps cada 15 días después de la recombinación utilizando RT-q-PCR en los animales CTRL y en los RyR1-Rec (Fig. 1c). Se observó una rápida caída del ARNm de RyR1, con un nivel bajo y estable del 21% ± 4% del valor inicial alcanzado tan pronto como 3 días después de la inyección de tamoxifeno. Se observó una reducción en todos los músculos analizados 75 días después de la inducción de la recombinación (cuádriceps, tibial anterior, EDL, sóleo, archivo adicional 1: Fig. S1A). La cantidad de proteína RyR1 se analizó además, mediante Western blot cuantitativo en los homogeneizados musculares del cuádriceps (Fig. 1d, e). Esta cantidad se redujo progresivamente y alcanzó aproximadamente el 50% del valor inicial después de 105 días. No se observó una mayor reducción de la proteína RyR1 en tiempos más largos (datos no mostrados). Se cuantificó la cantidad de proteína RyR1 en diferentes homogenados musculares 75 días después de la recombinación. Se observó una reducción en todos los músculos ensayados, aunque la cantidad restante difería ligeramente entre los músculos, siendo la mayor en el interóseo (64% ± 5%) y la menor en el sóleo (33% ± 5%) (archivo adicional 1: Fig. S1B).

Los ratones RyR1-Rec muestran una reducción progresiva del peso muscular y corporal y de la fuerza muscular

Las consecuencias de la reducción de RyR1 se estudiaron primero a nivel de todo el animal. Inicialmente con el mismo peso, los animales CTRL aumentaron lentamente de peso de 24,4 ± 0,4 a 30,6 ± 0,8 g a D90 mientras que los animales RyR1-Rec perdieron progresivamente peso hasta 20,6 ± 1,3 g a D90 (Fig. 2a). Tanto los machos como las hembras se vieron afectados y perdieron alrededor del 13% de su peso corporal inicial después de 75 días (archivo adicional 1: Fig. S1C). Se observó una pérdida de peso en todos los músculos (Archivo adicional 1: Fig. S1D). Para comprobar el rendimiento muscular general tras la reducción de RyR1, los animales fueron sometidos a dos pruebas de fuerza diferentes. En primer lugar, se les permitió colgarse agarrando una superficie con cables cruzados con las cuatro patas hasta 5 minutos, la latencia a la caída reflejaba la fuerza muscular. La prueba de agarre realizada cada semana durante 105 días (Fig. 2b) mostró que los animales RyR1-Rec empezaron a perder fuerza 20-30 días después de la inyección de tamoxifeno, cuando la cantidad de RyR1 era aproximadamente el 75-80% de su valor inicial, y fueron incapaces de colgarse de la rejilla unos 75 días después de la inyección de tamoxifeno, ya que la cantidad de RyR1 había alcanzado el nivel de aproximadamente el 60%. La fuerza muscular también se evaluó mediante un protocolo de electroestimulación no invasiva de 6 minutos del músculo gastrocnemio acoplado a una resonancia magnética anatómica (RM) bajo anestesia general. Durante el protocolo de electroestimulación de los animales CTRL 30 días después de la inyección de tamoxifeno (Fig. 2c, D30) se registró un perfil de ejercicio típico, con una fuerza muscular inicial estable que disminuyó lentamente a medida que el músculo se fatigaba. En el grupo CTRL a D60 y D90 el perfil de ejercicio mostró una mejora de la fuerza muscular cuando los animales envejecían (Fig. 2c). Por el contrario, el rendimiento de los animales RyR1-Rec, similar al de CTRL en D30, se deterioró con la edad. Los animales RyR1-Rec fueron incapaces de seguir realizando el ejercicio a D90 (Fig. 2c, RyR1-Rec D90). El volumen del gastrocnemio medido mediante imágenes de RM (Fig. 2d) permaneció estable en los animales CTRL desde D30 (161 ± 5 mm3) hasta D90 (164 ± 4 mm3). Por el contrario, en los ratones RyR1-Rec, el volumen del gastrocnemio fue significativamente menor que en los ratones CTRL desde D30 (141 ± 3 mm3, p = 0,003), y se redujo aún más hasta 100 ± 3 mm3 en D60 (p < 0,001 en comparación con CTRL a la misma edad) y 69 ± 4 mm3 en D90 (p < 0,001 en comparación con CTRL a la misma edad). La tensión de contracción específica máxima (tensión de contracción absoluta normalizada al volumen muscular) confirma que ambos grupos presentaban una fuerza muscular similar a D30 (Fig. 2e), pero la fuerza de los animales RyR1-Rec disminuyó drásticamente mientras que aumentó en los animales CTRL a medida que envejecían. Además, los cambios en la bioenergética del músculo gastrocnemio durante la electroestimulación se evaluaron de forma no invasiva a D60 utilizando espectroscopia de RMN de 31-fósforo (31P) in vivo. Mientras que el pH intramiofibrilar basal no difirió entre ambos grupos (archivo adicional 1: Fig. S2A), el grado de acidosis al final del ejercicio fue menor (p = 0,016) en los animales RyR1 Rec (archivo adicional 1: Fig. S2B), sugiriendo así que el flujo glucolítico en el músculo ejercitado se redujo en estos animales. Además, la constante de tiempo de la resíntesis de fosfocreatina después del ejercicio (τPCr) fue significativamente más corta (p = 0,047) en los ratones RyR1-Rec (archivo adicional 1: Fig. S2C, D), lo que refleja una mejor función mitocondrial in vivo. De hecho, la síntesis de PCr durante el período de recuperación posterior al ejercicio depende exclusivamente de la síntesis oxidativa de ATP, por lo que la τPCr se considera un índice de la capacidad de fosforilación oxidativa . En general, estos resultados indican que la reducción progresiva de RyR1 se asocia con una pérdida progresiva de peso y una caída de la fuerza muscular.

Las propiedades fisiológicas de las fibras aisladas están comprometidas en los ratones RyR1-Rec

La alteración de la función muscular se caracterizó además a nivel de la fibra muscular individual utilizando una combinación de pinzas de voltaje de células enteras e imágenes confocales . La red de túbulos T se visualizó tiñendo la membrana plasmática con di-8-anepps. No se observó ninguna diferencia cualitativa en la red (Fig. 3a, izquierda) ni cuantitativa en la densidad media de los túbulos T entre las fibras CTRL y RyR1-Rec, además de un ligero pero significativo acortamiento de la longitud media del sarcómero en reposo (Fig. 3a, gráficos de la derecha). Se evaluó simultáneamente el influjo de Ca2+ activado por voltaje a través del DHPR (Fig. 3b-d) y del flujo de liberación de Ca2+ a través del RyR1 (Fig. 3e-i). En comparación con las fibras CTRL, las fibras RyR1-Rec mostraron corrientes de Ca2+ activadas por voltaje en la DHPR con un curso temporal similar (Fig. 3b), pero con una densidad reducida, como muestra el pico de densidad de corriente frente al voltaje en los dos grupos (Fig. 3c), lo que se tradujo en una reducción del 30% en la conductancia máxima (Gmax) sin cambios asociados en los demás parámetros de la relación corriente frente a voltaje (Fig. 3d). La dependencia del voltaje de la liberación de Ca2+ del SR se evaluó a partir de imágenes de barrido lineal del colorante sensible al Ca2+ rhod-2. Las imágenes de barrido lineal de las fibras RyR1-Rec fueron cualitativamente similares a las de las fibras CTRL (Fig. 3e), mostrando un rápido aumento de la fluorescencia tras la despolarización de la membrana del túbulo T, espacialmente homogéneo a lo largo de la línea de barrido. La tasa de liberación de Ca2+ del SR (Fig. 3g), calculada a partir de los cambios en la fluorescencia rhod-2 provocados por pulsos despolarizantes de amplitud creciente (Fig. 3f), mostró un curso temporal similar en la fibra RyR1-Rec que en las fibras CTRL, pero, de manera importante, los valores máximos se redujeron en RyR1-Rec. El ajuste de la tasa máxima de liberación de Ca2+ del SR frente al voltaje (gráfico superior de la Fig. 3h) indicó que la tasa máxima de liberación de Ca2+ se redujo en un 25% en el grupo RyR1-Rec (Fig. 3i, Max), el factor de pendiente (k) también se redujo ligera pero significativamente, mientras que el voltaje de activación media (V0,5) no cambió. Se observó un ligero (1,3 ms de media) pero significativo aumento de la tasa de tiempo hasta el pico de liberación de Ca2+ del SR en las fibras RyR1-Rec (Fig. 3h, gráfico inferior). No se observaron modificaciones en la capacidad de eliminación del Ca2+ citosólico de las fibras (función de la bomba SERCA), medida con el colorante de baja afinidad sensible al Ca2+ fluo-4 FF en condiciones de no-EGTA (archivo adicional 1: Fig. S3). En general, estos resultados demuestran que la reducción del 35% en la cantidad de RyR1 en los interóseos se asocia con una reducción del 30% en la corriente de calcio a través de DHPR y una reducción del 25% en el flujo de calcio a través de RyR1.

La reducción de RyR1 afecta a la estructura del músculo esquelético

Para comprender mejor la base de estas alteraciones funcionales asociadas a una disminución de RyR1, se estudió la estructura muscular en animales RyR1-Rec en D75 después de la recombinación, y se comparó con animales CTRL. Se analizaron el extensor largo de los dedos (EDL), un músculo de contracción rápida, el sóleo, un músculo de contracción lenta, y el tibial anterior (TA), un músculo mixto, utilizando tinciones de hematoxilina-eosina, NADH y tricromía de Gomori. Las tinciones del TA, presentadas en la Fig. 4a, muestran una estructura muscular anormal en los animales RyR1-Rec, sin fibrosis ni núcleos centrales, pero con atrofia de las fibras, que afecta tanto a las fibras de tipo I como a las de tipo II (Tabla 2). Se observa una desorganización de las mitocondrias caracterizada por la acumulación/depuración local en regiones adyacentes de la misma fibra (cabeza de flecha y recuadro de la Fig. 4a) y la acumulación de tinción roja observada con el tricrómico de Gomori (archivo adicional 1: Fig. S4), que se asemeja a los núcleos polvorientos descritos recientemente en pacientes . Se observó atrofia de fibras en ambos tipos de fibras en la EDL, aunque la reducción fue ligeramente más importante en las fibras de tipo I (Tabla 2). Se tiñeron secciones transversales de AT de ratones CTRL y RyR1-Rec con anticuerpos contra RyR1 y desmina. No se observó ninguna modificación en la distribución de RyR1 entre las fibras de tipo I y de tipo II en las secciones de AT de RyR1-Rec, lo que indica una reducción similar de RyR1 en todos los tipos de fibras (Fig. 4b). Sorprendentemente, se observó una importante modificación en la distribución de la desmina, con un enorme aumento en las fibras pequeñas de tipo I (Fig. 4b): en las secciones de AT CTRL, todas las fibras presentaban una tinción periférica similar, mientras que las fibras pequeñas de tipo I en las secciones de AT RyR1-Rec estaban muy teñidas tanto en la periferia de la fibra como en el citosol (recuadro Fig. 4b). Aunque el etiquetado IF no es cuantitativo, estos resultados muestran que la reducción de RyR1 fue muy probablemente homogénea, sin ninguna gran diferencia entre fibras adyacentes como se observó para la desmina, siendo la cuantificación realizada por Western blot el reflejo de la proteína contenida en cada fibra y no una media de fibras con 0% de RyR1 y fibras con 100% de RyR1 dentro del mismo músculo.

La organización de las tríadas se estudió además utilizando el etiquetado inmunofluorescente de las fibras EDL aisladas (Fig. 5a). El etiquetado de alfa-actinina (como marcador de la línea Z), de triadina y de RyR1 (como marcadores de tríadas) en la fibra EDL RyR1-Rec demostró que la reducción de la cantidad de RyR1 dio lugar a una desorganización generalizada de la fibra con una localización anormal de las tríadas y una interrupción de la línea Z, pero la triadina y el RyR1 seguían estando parcialmente colocalizados. Aunque las tríadas permanecían a ambos lados de la línea Z, ésta no formaba una línea recta como en CTRL y, en cambio, presentaba muchas microdisrupciones (inserto de la Fig. 5a). La ultraestructura muscular se analizó mediante microscopía electrónica en las fibras RyR1-Rec EDL en D75 (Fig. 5b). Algunas regiones tenían una estructura relativamente preservada (Fig. 5b, fibra izquierda), mientras que algunas regiones adyacentes estaban altamente desorganizadas, con la interrupción de la organización regular del sarcómero, la desorganización de las mitocondrias, y la presencia de numerosos apilamientos de membrana (Fig. 5b, flechas, ampliadas en el recuadro), previamente llamados tríadas múltiples . Las características morfológicas de esas tríadas múltiples comparadas con las tríadas simples normales se presentan en la Tabla 3, y se presentan ejemplos adicionales en el archivo adicional 1: Fig. S5. La cuantificación precisa de la anchura putativa de los túbulos T, de la anchura putativa de los SR y del espacio intermembrana (túbulos T/SR) (archivo adicional 1: Fig. S5) demostró un enorme aumento del tamaño medio de los túbulos T en esas tríadas múltiples (aumento del doble, alcanzando el 202% del tamaño de los túbulos T en la tríada normal), mientras que la anchura media de los SR sólo aumentó ligeramente (+ 10%) y el espacio intermembrana no se modificó. Estos resultados apuntan a una desorganización estructural generalizada de los músculos de los ratones RyR1-Rec asociada a la remodelación de las membranas.

La reducción de RyR1 se asocia con la modificación de la cantidad de numerosas proteínas

Las consecuencias de la reducción de RyR1 se estudiaron a nivel molecular mediante Western blot cuantitativo en el músculo cuádriceps de ratones CTRL o RyR1-Rec (8 animales en cada grupo) en D75 después de la inyección de tamoxifeno (Fig. 6). Se estimó la cantidad relativa de numerosas proteínas implicadas directa o indirectamente en el manejo del calcio, utilizando como referencia la cantidad total de proteínas determinada por la evaluación sin tinción . No se observaron diferencias en la cuantificación de RyR1 entre este método y el uso de la cadena pesada de miosina como proteína de referencia (comparación entre las Figs. 1, 6). No se observó ninguna modificación significativa entre los músculos CRTL y RyR1-Rec en la cantidad de la isoforma T95 de la triadina, la proteína de unión al calcio CSQ1, la Ca2+-ATPasa SERCA, la FoF1-ATPasa mitocondrial y la subunidad alfa 1 de la DHPR (Fig. 6a, b). Por el contrario, se observó un aumento en la cantidad de STIM1 (× 3,7 ± 1, p = 0,02), la isoforma de triadina T51 (× 1,6 ± 0,1, p < 0,001), CLIMP63 (× 1,8 ± 0,2, p = 0,004) y ORAI1 (× 3,7 ± 1, p = 0,017). Como se observó una modificación en la localización de la proteína estructural desmina utilizando el etiquetado de inmunofluorescencia (Fig. 5b), también se cuantificó el nivel de expresión de desmina y se observó un enorme aumento en la cantidad de desmina (× 8,2 ± 1,2, p = 0,001). Se analizó la localización de CLIMP63 y STIM1 en las fibras EDL de RyR1-Rec mediante etiquetado inmunofluorescente, y no se observó ninguna modificación importante (archivo adicional 1: Fig. S6). Por lo tanto, la reducción de la proteína RyR1 se asoció con un aumento de diferentes proteínas implicadas en la regulación del calcio o en la arquitectura muscular.

La autofagia se altera como resultado de la reducción de RyR1

La alteración de la autofagia se ha observado en algunas miopatías . Para identificar los mecanismos que conducen a la atrofia muscular subsiguiente a la reducción de RyR1, buscamos modificaciones en el flujo de autofagia en los músculos RyR1-Rec. La cantidad de LC3 II, una proteína de membrana de los autofagosomas, se evaluó con Western blot cuantitativo (Fig. 7a, b), y se observó un aumento de LC3 II (172% ± 32%, p = 0,03). Este aumento de los autofagosomas podría reflejar tanto un aumento de la formación de autofagosomas (debido a un aumento del proceso de autofagia) como una disminución de su fusión con los lisosomas (y por tanto una inhibición de la degradación de la autofagia). La naturaleza precisa de la modificación del flujo de autofagia se analizó además mediante la cuantificación de p62, una conocida proteína que se degrada específicamente a través de la autofagia, cuya cantidad también aumentó significativamente (Fig. 7a, b, 172% ± 22%, p = 0,006). El aumento asociado de LC3 II y de p62 en el músculo RyR1-Rec en comparación con el control sugirió que la reducción de RyR1 estaba por tanto asociada a la inhibición del flujo de autofagia. Además, se observó un aumento en la activación (fosforilación) de dos inhibidores de la autofagia, mTOR y la proteína S6 (Fig. 7b, c), (el aumento de P-mTOR/mTOR en 174% ± 17%, p = 0,01; el aumento de P-S6/S6 en 320% ± 50%, p < 0,001). El aumento de la fosforilación de estos dos inhibidores de la autofagia en los animales RyR1-Rec en comparación con los controles apuntaba aún más a una inhibición de la autofagia responsable de la atrofia muscular en los animales RyR1-Rec.

Las biopsias de pacientes humanos muestran defectos similares a los observados en los ratones RyR1-Rec

En un estudio reciente sobre una gran cohorte de pacientes con una miopatía congénita recesiva , hemos identificado la presencia de estructuras atípicas, denominadas «núcleos polvorientos», en más de la mitad de los pacientes con una reducción de la cantidad de RyR1. Se observaron mediante tinción múltiple y se diferencian del núcleo central clásico (regiones bien definidas sin tinción oxidativa) por sus bordes mal definidos, su desorganización miofibrilar focal, un depósito de material granular rojizo-púrpura en la tinción de tricrómico de Gomori y un área mezclada con una actividad enzimática disminuida o/y aumentada en las tinciones oxidativas (archivo adicional 1: Fig. S7). Estas alteraciones estructurales reflejan las modificaciones observadas en nuestro modelo de ratón (Fig. 4 y archivo adicional 1: Fig. S7). Por lo tanto, comparamos aún más nuestro nuevo modelo de ratón y las biopsias musculares de pacientes con una reducción de la proteína RyR1 y «núcleos polvorientos». Utilizando el Western blot cuantitativo, se estimó también la cantidad de las proteínas que estaban claramente modificadas en nuestro modelo de ratón en 5 pacientes con una enfermedad recesiva Dusty Core (dos mutaciones de RyR1 que dan lugar a una reducción de la proteína RyR1-Fig. 8a). Se utilizaron como referencia biopsias de control de diferente edad (entre 3,5 y 64 años). Se observó una gran reducción de la proteína RyR1 en todos los pacientes (nivel medio de expresión 19,8% ± 2,2% de CTRL, p < 0,001). Además, también se observó un aumento de CLIMP63 y desmina. La reducción de RyR1 se asoció con un aumento importante de CLIMP 63 (el nivel de expresión medio se quintuplicó, 516% ± 220%). Además, el nivel de expresión de la desmina también aumentó drásticamente en los pacientes en comparación con el control (aumento medio del nivel de expresión de 240 veces, 24 170% ± 7 635%). Utilizando la microscopía electrónica para analizar la ultraestructura de las biopsias de los pacientes, se observaron muchos apilamientos de membranas en las regiones desorganizadas (Fig. 8c, flechas) de todos los pacientes. Estas regiones, similares a los apilamientos observados en el músculo RyR1-Rec (Fig. 4b), apuntaban a un mecanismo común, tanto en ratones como en humanos, que conducía a la formación de esas estructuras como resultado de la reducción de RyR1. Con modificaciones idénticas a las de los pacientes de la Enfermedad del Núcleo Polvoriento, este modelo constituye, por tanto, un modelo relevante para estudiar los mecanismos fisiopatológicos.