Contenido y propiedades del fluido intracelular

Este capítulo es vagamente relevante para la sección E(iv) del programa de estudios de primaria del CICM de 2017, que espera que el candidato al examen «describa la composición …del fluido intracelular». Debido a que esta es la sección de fisiología celular, el enfoque aquí será principalmente en el nivel micro de organización, y toda la discusión del compartimiento de fluido corporal intracelular se dejará para la sección de fluidos corporales.

El hecho de que los examinadores universitarios nunca hayan centrado su atención en este tema confiere un aire casi liberador de inutilidad a la discusión del mismo, ya que tanto los candidatos al examen como el autor son agradablemente conscientes de que cada uno está perdiendo el tiempo del otro. En lugar de empaparse de la ciencia pura y dura y de memorizar hechos examinables, uno puede seguir leyendo fácilmente por razones puramente de entretenimiento médico, o pasar a temas que atraen más puntos.

En resumen:

¿Cuáles son los recursos válidos revisados por pares para este tema? Por desgracia, son numerosos. Cuando uno utiliza un motor de búsqueda o la sección del índice de un libro de texto para buscar «líquido intracelular», inevitablemente hay una respuesta, una serie de entradas o páginas o diapositivas de powerpoint que -aunque todas vagamente similares en su contenido- difieren en sus valores citados, y no ofrecen nada en forma de referencias. Muchas no ofrecen ninguna información útil. Por ejemplo, en los libros universitarios oficiales sobre este tema (Ganong, p. 2 de la 23ª edición, y Guyton & Hall, p. 4 de la 13ª edición), se habla de concentraciones de electrolitos citosólicos utilizando términos como «grandes cantidades». Incluso fuera de la bibliografía oficial, ofertas por lo demás sólidas como Molecular Biology of the Cell no tienen respuestas directas. Ni siquiera se ponen de acuerdo en cómo llamarlo (¿citosol? ¿Protoplasma? ¿Primordialschlauch?)

Afortunadamente, todavía hay científicos que publican sobre este tema. Probablemente el mejor artículo es el de 1999 de Katherine Luby-Phelps, que básicamente contiene todo lo que podrías necesitar para responder a cualquier hipotético SAQ futuro sobre este tema. Otra entrada excelente que trata principalmente de las propiedades del material intracelular es el breve artículo de Richard P. Sear (2005). Si uno está realmente loco y dispone de los recursos de tiempo de un especialista de plantilla contratado permanentemente (es decir, sin obligación urgente de realizar realmente ningún trabajo útil) puede, en cambio, explorar In Search of the Physical Basis of Life (1984) de Gilbert Ling, un libro de 800 páginas escrito por un hombre cuyas publicaciones sobre fisiología celular se extienden hasta la década de 1950.

Volumen de un espacio intracelular

¿Qué tamaño tiene una célula? Obviamente, eso depende de la célula. Un buen ejemplo de célula atípica es el ovocito de Xenopus, el huevo de un sapo de garras africano que tiene 1 mm de diámetro. Cuando se habla de los seres humanos, uno suele referirse al fluido intracelular como si fuera un cubo relativamente homogéneo, pero en realidad ese compartimento de fluido está compuesto por algo así como 1014 compartimentos minúsculos, cada uno de los cuales tiene un volumen y una composición ligeramente diferentes.

La heterogeneidad de todos estos volúmenes está bien resumida en este capítulo de la base de datos BioNumbers, donde se puede encontrar todo tipo de información meticulosamente referenciada. Se reproduce aquí con una mínima modificación, por si alguna vez se caen los servidores de Harvard.

Volúmenes de células de mamíferos

Tipo de célula	Volumen (μm3, o femtolitros)	Volumen (picolitros)	Referencia
Célula espermática	30	0.03	Gilmore et al, 1995
Eritrocitos	100	0.1	Ballas et al, 1987
Linfocitos	130	0,13	Schmid-Schonbein et al, 1980
Neutrófilos	300	0.3	Rosengren et al, 1994
Célula β pancreática	1,000	1.0	Finegood et al, 1995
Enterocito	1,400	1,4	Wiśniewski et al, 2012
Fibroblasto	2,000	2.0	Mitsui et al, 1976
Tumor cervical (HeLa)	3,000	3,0	Zhao et al, 2008
Célula capilar (oreja)	4,000	4.0	Géléoc et al, 1999
Osteoblasto	4,000	4,0	Beck et al, 2011
Macrófago alveolar	5,000	5.0	Krombach et al, 1997
Megamiocitos	15.000	15,0	Calvillo et al, 2003
Megacariocitos	30.000	30.0	Harker et al, 2000
Adipocitos	60,000	60.0	Livingston et al, 1984
Ovocito	4.000.000	4000	Goyanes et al, 1990

Así que es un rango bastante amplio. Además, obviamente no todo el contenido de la célula va a estar ocupado por «líquido intracelular», independientemente de cuál sea tu definición de ese término. Por ejemplo, a efectos de este capítulo, la definición de fluido intracelular será «contenido intracelular que no son orgánulos», simplemente porque los orgánulos se tratan en otro capítulo. De lo que estamos hablando, en ese caso, es de la «sustancia grisácea, viscosa, viscosa, semitransparente y semifluida» que ocupa el espacio intracelular entre otras estructuras (Harvey, 1937).

Dependiendo del tipo de célula que se esté viendo, ese espacio podría ser una proporción muy pequeña del volumen total. Por ejemplo, en el adipocito omental abovelado, de esos 60 picolitros de volumen total, la gran mayoría estará ocupada por grasa sin agua. Esto se puede comprobar experimentalmente: DiGirolamo & Owens (1976) pudo calcular que el volumen de agua en los adipocitos de rata era de aproximadamente el 5-7% del volumen total, es decir, 1,5-2 picolitros.

En resumen, estamos ante un volumen muy pequeño. ¿Por qué es importante? Bueno. El volumen líquido interno de la célula, de 1-2 picolitros, es el volumen de distribución de las sustancias solubles. Por tanto, las moléculas de esas sustancias tienen una distancia muy corta que recorrer antes de encontrarse. El efecto es aumentar la velocidad de las reacciones, lo cual es útil porque la cantidad total de moléculas de reactivos para un volumen tan pequeño es necesariamente pequeña. Tomando un ejemplo de Luby-Phelps (2000), si una célula tiene un contenido total de 1 nanomol de una proteína, eso significa que sólo hay 1000 copias de esa proteína presentes en la célula. Afortunadamente, con un volumen tan pequeño para atravesar, una molécula de unión con afinidad incluso baja sería capaz de fregar y adsorber la mayoría del sustrato disponible.

El contenido de la proteína del líquido intracelular

Ok, así que el volumen es pequeño. Qué macromoléculas hay en él, y cuántas de ellas? Alice B. Fulton (1982) intervino en esta cuestión con, probablemente, la respuesta más lúcida de la literatura publicada. Básicamente, el contenido proteínico de las células se sitúa entre el 17 y el 35% en peso, y la mayoría de los autores se sitúan en un rango de 20-30g/100ml. Fulton cita textos antiguos (Loewy et al, 1969) para dar los siguientes valores:

• Células musculares: 23% de proteínas en peso
• Eritrocitos: 35% de proteína en peso
• La mayoría de las otras células: 17% a 26% de proteína en peso

Las mediciones suelen hacerse por medio de mediciones del índice de refracción, que es una técnica que no suele discriminar entre las proteínas estructurales (por ejemplo, las que componen el citoesqueleto y los orgánulos) y las proteínas solubles que componen el resto de la sustancia viscosa.

Entonces, ¿qué sentido tiene esta discusión? Pues que. Esta concentración de proteínas es bastante alta. Está por encima de la concentración normalmente aceptada de polímeros grandes que se esperaría que afectara a la difusión de otros polímeros similares, es decir, el bosque es demasiado denso. Chang et al (1987) produjeron un modelo matemático que predice que para los polímeros de 50kDa y superiores, ese límite de difusión es de alrededor de 130g/L, es decir, cualquier cosa más que eso y otros polímeros no podrán difundirse fácilmente a través de la solución. Claro, estaban usando poliestireno disuelto en benceno, pero el hecho sigue siendo. Para comparar, cuando uno cristaliza completamente una proteína, uno termina con un «sólido» que es sólo el 40% de proteína en peso

En resumen, las proteínas en el fluido intracelular están empaquetadas tan estrechamente que el citosol tiene que ser descrito como una «solución abarrotada». El diagrama en forma de caricatura que aparece aquí (publicado originalmente por Goodsell en 1993, y reproducido posteriormente por prácticamente cualquier persona que haya escrito sobre el citosol) demuestra visualmente lo apretados que están esos cuerpos. El dibujo fue aproximado, utilizando tamaños y formas conocidas de moléculas/microscopio de electrones, pero las imágenes tomadas a través del SEM (por ejemplo, por Bridgman & Reese, 1984) demuestran que representa correctamente la desordenada microestructura del citosol. Observando los ovocitos de Xenopus a un aumento de ~ 80.000, se hace evidente un denso bosque de filamentos y gránulos. La imagen aquí (una parte de su Figura 6) fue limpiada un poco por la lisis celular y el lavado con detergente, para eliminar parte de la carga de proteínas que de otro modo oscurecía la estructura más fina. Las flechas apuntan a las uniones de los filamentos Y y T.

Sin la preparación con detergente, todo el fino material granular empaquetado entre estos filamentos se hace visible. La imagen se asemeja ahora al ruido blanco (mismos autores).

Claramente, la difusión a través de este matorral no va a ser normal. Los solutos más pequeños (por ejemplo, sus iones de sodio y potasio) tienen que navegar alrededor de estos enormes obstáculos, tomando la ruta escénica hacia los demás. Desde un punto de vista práctico, esto debería significar que cualquier reacción que dependa de la velocidad de difusión va a ser más lenta. Si las moléculas tardan una eternidad en llegar unas a otras, seguramente la velocidad neta de su interacción debería reducirse. Sin embargo, no vemos esto.

¿Qué propiedades químicas vemos, con esta sopa proteinácea altamente saturada? Allen P. Minton (2006) ha resumido años de investigación (principalmente la suya propia) en una tabla del documento citado anteriormente. Se resume aquí:

• Aumento de la afinidad de unión de macromoléculas de otro modo diluidas entre sí
• Aceleración de las asociaciones de proteínas, por ejemplo. autoensamblaje
• Desaceleración de las reacciones limitadas por difusión y de las asociaciones de proteínas
• Estabilización de las proteínas contra la desnaturalización por calor

En resumen, la aglomeración obliga a las proteínas a plegarse e interactuar, lo que produce configuraciones complejas que de otro modo serían imposibles en una solución diluida. Por ejemplo, Wilf & Minton descubrió en 1981 que las moléculas de mioglobina diluidas en solución tienen poco interés entre sí, pero la adición de una solución al 10% de (¡cualquier!) otra proteína hace que la mioglobina se ensamble espontáneamente en dímeros.

Propiedades del agua intracelular

Incluso en una proteína cristalizada, sólo el 40% de la masa es proteína real. El resto es disolvente que ocupa los espacios entre las moléculas de proteína empaquetadas (no son exactamente rectángulos, y no se apilan ordenadamente). Cuando el disolvente es agua, la mitad acaba adsorbida en la superficie de la proteína, pero el resto puede seguir viéndose como agua líquida normal. En esta fina película, los iones del agua intracelular están disueltos.

Claramente, con el agua adsorbida unida, las cosas son ligeramente diferentes. Por ejemplo, las propiedades solventes de esta agua no van a ser exactamente las mismas que las del agua «libre». Por un lado, probablemente tendrá una actividad química reducida. Como cabría esperar, el estado «ordenado» del agua le confiere varias propiedades coligativas inusuales; por ejemplo, Foster et al (1976) descubrieron que su punto de congelación está deprimido. Además, va a haber bolsas de citosol con actividad aumentada (alrededor de las estructuras proteicas hidrofílicas) y actividad disminuida (alrededor de las hidrofóbicas).

¿Cuánto del agua es mantenido en este estado cautivo por las proteínas? Eso es algo difícil de decir. Los experimentos de Ling et al (1993) sugieren que en el interior de las células, la mayor parte del agua está «ordenada» de esta manera, pero la mayoría de los experimentos que informan sobre este tema se ven algo afectados por el hecho de que las células vivas crudas que están utilizando tienen diversas respuestas homeostáticas a las condiciones experimentales que confunden los hallazgos.

Generalmente, la gente trata de establecer esta respuesta deshidratando osmóticamente las células. Aplican una presión osmótica, razonan, y toda el agua «móvil» debería salir de la célula. Entonces se mide el contenido de agua de la célula, y todo lo que queda debe ser «inmóvil», estacionado en la superficie de las moléculas de proteínas e incapaz de migrar en respuesta a la presión osmótica. Cameron et al (1997) presentan el gráfico (robado descaradamente y mostrado aquí, a la izquierda) en el que el contenido de agua de las células restantes se traza contra un eje x de presión osmótica creciente. La línea de presión frente al agua restante, cuando se extrapolaba a partir de las pruebas experimentales y se extendía hacia una presión osmótica «infinita», acababa cruzando el eje y en algún punto distinto de cero. Dependiendo de las células que se utilizaran, eso terminaba siendo entre el 30-90% del contenido total de agua.

De hecho, parece que esta agua adsorbida a las proteínas es el agua esencial en las células, y toda el agua «libre» es un lastre inútil. Clegg (1981), rehidratando algunas células secas de camarón de salmuera, descubrió que la actividad metabólica se reanudaba y era relativamente normal cuando las células se restablecían con aproximadamente un 35% de agua en peso, es decir, más o menos lo que se espera para «hidratar» todas las macromoléculas. En esas gambas, es casi seguro que no había agua libre en «fase masiva». Por supuesto, no trataban de reproducirse ni de sintetizar ARN (que requiere una hidratación de hasta el 70-80%), pero la síntesis de aminoácidos y el intercambio de gases se desarrollaban con relativa normalidad. Esto hace aún más notable el hecho de que cuando se mide objetivamente, esta espesa sopa de proteínas del 20-30% tiene una viscosidad que se asemeja mucho al agua normal (Luby-Phelps, 1994)

PH del líquido intracelular

Carter (1972) publicó un artículo muy influyente sobre esto, que se cita a menudo en los libros de texto de fisiología humana, a pesar de que el autor utilizó músculos del percebe gigante (Balanus nubilus) que suspendió en algo llamado «solución de Ringer del percebe», una salmuera con 450 mmol/L de sodio y 518 mmol/L de cloruro. Difícilmente se puede seguir leyendo con algún nivel de respeto por la generalizabilidad humana de tales datos, pero si uno lo hace descubriría el hallazgo más importante: que el pH en las células está tan compartimentado que diferentes regiones del citosol tenían valores de pH salvajemente diferentes, en un rango de 6,0 a 7,5.

Concentraciones de electrolitos intracelulares

En general, todos los libros de texto, cuando se les pregunta por la concentración de electrolitos en el fluido intracelular, producirán un Gamblegrama como éste (malversado de Ling, 1984, sin permiso de su patrimonio o de su editor).

Este diagrama no se menciona en el libro de Ling, pero se podría argumentar que no tiene por qué hacerlo, teniendo en cuenta que Ling realizó prácticamente todo el trabajo pionero para determinar el comportamiento de los solutos intracelulares. Concretamente, en la década de 1960, él y Ochsenfeld determinaron que este potasio (y todos los demás electrolitos del citosol) no suele estar presente en una forma libremente disponible, sino que se adsorbe en las estructuras macromoleculares.

Los investigadores desafiaron a las células con isótopos radiomarcados y descubrieron que esto tenía poco efecto en el desplazamiento de los electrolitos ya presentes allí, lo que se habría esperado si se hubieran distribuido libremente. Los electrolitos intracelulares están presentes en gran medida en complejos con macromoléculas y son mucho menos móviles de lo que cabría esperar de un modelo de célula en el que todo el contenido existe en un saco acuoso homogéneo. Los mismos autores (Ling & Ochsenfeld, 1973) confirmaron posteriormente que la movilidad del potasio desde el compartimento intracelular al extracelular era aproximadamente una octava parte de lo que cabría esperar de la simple difusión en solución libre. El músculo de rana muerto filtró potasio con algo más de facilidad (la tasa de difusión sólo se redujo en un 25% respecto a la esperada), ya que las bombas accionadas por ATP dejaron de funcionar y la estructura de las proteínas se desorganizó.

Así pues, convengamos en que estos iones no están disueltos en un lago revuelto de agua libre intracelular, sino que están unidos en complejos. Eso todavía no responde a la pregunta: ¿cuánto de lo que hay allí? Resulta que es relativamente fácil de responder. Mucho más fácil, de hecho, que cualquiera de las otras preguntas planteadas hasta ahora en este capítulo. Basta con tomar el citosol, liofilizarlo y luego medir la composición elemental de la masa seca. Mason et al (1981) hicieron exactamente esto para algunas células tubulares renales, antes y después de la lesión isquémica. Sus resultados se reproducen a continuación, tanto en forma de la tabla original de 1981 como en un bonito y brillante Gamblegrama:

Como se puede ver por las fluctuaciones salvajes de la concentración de potasio después de incluso 20 minutos de isquemia, la composición de electrolitos de las células es mucho más fluida que la del líquido extracelular (donde un cambio de 20mmol en la concentración de cualquier electrolito sería mal tolerado, a un nivel de supervivencia del organismo). Además, cada linaje celular tendrá una concentración de iones intracelular ligeramente diferente. Esto da lugar a la imprecisión de los valores de electrolitos intracelulares que se discuten en los libros de texto, y a su reticencia general a citar cualquier número. Prácticamente cualquier número que se cite será erróneo. Por ejemplo, los túbulos distales de Mason tenían 11mmol/L de sodio en su citosol, pero Poole-Wilson (1975) encontró unos 44mmol/L en los miocitos del ventrículo izquierdo y 20mmol/L en el cuádriceps izquierdo. Alam et al (1977) dan valores de unos 25 mmol/L para el sodio y 145 mmol/L para el potasio en algunas células hepáticas fallidas. En resumen, el entorno desordenado e imprevisible de cualquier célula hace difícil citar cifras específicas.