Počet kopií metylované O6-metylguanin-DNA metyltransferázy (MGMT) se stanovuje vzhledem k počtu kopií beta-aktinu (ACTB) pomocí metylačně specifické polymerázové řetězové reakce (MSP) v reálném čase. Za tímto účelem se obsah nádorové tkáně obohatí manuální mikrodisekcí a následnou extrakcí DNA. DNA se kvantifikuje pomocí Picogreenu a modifikuje se ošetřením bisulfitem, který způsobuje přeměnu nemetylovaných cytosinů na uracyl, zatímco metylované cytosiny zůstávají beze změny. Následně se na přístroji Quantstudio 5 provede metylačně specifická PCR (MSP) v reálném čase, aby se kvantifikoval počet kopií MGMT a ACTB (1). Tato technika spočívá v provedení PCR s detekcí v reálném čase pomocí amplifluorového detekčního systému. Vzorky s neznámým počtem kopií lze kvantifikovat porovnáním jejich hodnot Ct s hodnotami standardní křivky plazmidu.
Klinický význam
MGMT je opravný enzym DNA, který je u lidských nádorů často deaktivován hypermetylací. Pokud buňkám chybí aktivita MGMT, poškození DNA není správně opraveno, což činí jedince náchylnějším ke vzniku rakoviny. Zajímavé je, že tento nedostatek aktivity MGMT také činí nádorovou buňku citlivější na radioterapii a některé alkylační léky, jako je temozolomid (2). V mezinárodní prognostické validační studii fáze III (RTOG 0525) test MGMT úspěšně identifikoval nově diagnostikované pacienty s glioblastomem, u nichž je větší pravděpodobnost delšího života a delšího období bez progrese po léčbě temozolomidem (3-5). Nedávno byla zveřejněna nová publikace, ve které měli pacienti s metylací i pacienti v „šedé zóně“ výrazně lepší výsledky z hlediska celkového přežití než pacienti skutečně nemetylovaní (6).
Požadavky na vzorky
Přijatelné vzorky pro test jsou vzorky tkáně gliomu fixované ve formalínu a zalité do parafínu s dobou fixace 6-48 hodin.
Objem
Upřednostňuje se jeden reprezentativní blok parafínu. Alternativně je přijatelných 5 nebarvených tkáňových řezů (1 sklíčko o tloušťce 5 µm pro barvení H&E a minimálně 4 sklíčka o tloušťce 5-10 µm pro testování MGMT).
Pokyny pro skladování a přepravu
Skladujte a přepravujte vzorky při pokojové teplotě.
Omezení
U některých vzorků bude získán neplatný výsledek z důvodu nedostatečného počtu kopií ACTB v kombinaci s počtem kopií MGMT pod mezí detekce. Většinou se to vysvětluje nedostatečným množstvím a/nebo kvalitou DNA. U neplatných vzorků s počtem kopií MGMT a/nebo ACTB kolem LOD/LOQ a mezní hodnoty se doporučuje provést opakovaný test od DNA ošetřené bisulfitem. Jiná fixační činidla než formalín nebo prodloužená doba fixace mohou vést k neadekvátním výsledkům.
Speciální požadavky
Žádné
Turn-Around Time
Pět až 7 pracovních dnů pro sklíčka a parafínové bloky.
- Vlassenbroeck I et al. Validation of Real-Time Methylation-Specific PCR to determine O6-Methylguanine-DNA Methyltransferase Gene Promotor Methylation in Glioma. J Mol Diagn. 2008 Jul;10(4):332-7
- Hegi ME et al. MGMT gene silencing and benefit from temozolomide in glioblastoma. N Engl J Med 2005 Mar 10;352(10):997-1003.
- Gilbert MR et al. Dose-dense temozolomide for newly diagnosed glioblastoma: a randomized phase III clinical trial(7). J Clin Oncol. 2013 Nov 10;31(32):4085-91.
- Malmström A et al. Temozolomid versus standardní 6týdenní radioterapie versus hypofrakcionovaná radioterapie u pacientů starších 60 let s glioblastomem: Skandinávská randomizovaná studie 3. fáze. Lancet Oncol 2012 Sep; 13(9): 916-926.
- Wick W et al. Temozolomide chemotherapy alone versus radiotherapy alone for malignant astrocytoma in the elderly: the NOA-08 randomized, phase 3 trial. Lancet Oncol 2012 Jul; 13(7): 707-715.
- Hegi ME et al. MGMT Promoter Methylation Cutoff with Safety Margin for Selecting Glioblastoma Patients into Trials Omitting Temozolomide. Souhrnná analýza čtyř klinických studií. Clin Cancer Res 2019 Mar 15; 25(6): 1809-1816.
Aktualizováno 23. května 2019
.