Techniky fluorescenčních protilátek

By Benedette Cuffari, M.Sc.Reviewed by Emily Henderson, B.Sc.

Od svého původního objevu v roce 1942 zůstává imunofluorescenční barvení vysoce spolehlivou a výkonnou technikou pro širokou škálu výzkumných a diagnostických účelů.

Leukemické buňky označené fluorescenčními molekulami. Obrázek: Vshivkova/.com

Všeobecně budou fluorescenční protilátkové techniky (FA) zahrnovat použití buněk nebo protilátky, jejíž konstantní oblast byla označena fluorescenční značkou jinak známou jako fluorofor. Techniky FA se často dělí na přímé nebo nepřímé.

Přímá fluorescenční protilátka

Přímá technika fluorescenční protilátky, kterou lze jinak označit jako přímou imunofluorescenci (DIF), zahrnuje použití jedné fluorescenčně značené primární protilátky, která se používá k vazbě na cílový antigen. Při klinickém použití je DIF užitečná zejména pro rychlou diagnostiku bakteriálních onemocnění, jako je Streptococcus pyogenes, který je známý spíše jako streptokok, a také pneumonie, která je důsledkem buď druhu Mycoplasma pneumoniae, nebo druhu Legionella pneumophilia.

Pro tyto diagnostické účely se vzorek pacienta nejprve umístí na mikroskopické sklíčko a poté se vystaví fluorescenční protilátce. Jakákoli vazba mezi fluorescenčně značenou protilátkou a cílovým antigenem, což by pro tyto situace byly bakterie, způsobí, že se tyto látky při vyšetření fluorescenčním mikroskopem osvětlí.

Kromě použití jako diagnostický nástroj se DIF také široce používá pro vědecké výzkumné studie. Pro tyto účely se zmrazený vzorek tkáně, který byl rozřezán na 5 nebo 6 mikrometrů (µm) tenké řezy, umístí na skleněné sklíčko.

Sklíčka se poté inkubují s fluorescenčně značenou protilátkou, která obvykle zahrnuje panel protilátek namířených proti izotypům protilátek IgA, IgG a IgM spolu s komplementem 3, který je namířen proti antigenu zájmu.

Všimněte si, že koncentrace protilátky použité pro tento typ studie bude vycházet z předchozích experimentů, které potvrdily, jakou koncentrací lze dosáhnout nejvyššího poměru signálu k pozadí.

Po inkubaci preparátů po dobu nejméně 30 minut ve tmě a při pokojové teplotě se preparáty promyjí a poté se zobrazí pomocí fluorescenčního mikroskopu.

Obrázek: Anyaivanova/.com

Přímá fluorescenční protilátka

V porovnání s jednostupňovou technikou používanou pro DIF je nepřímá IF (IIF) nebo nepřímá FA (IFA) dvoustupňový proces, který začíná aplikací neznačené primární protilátky na vzorek, která je namířena proti cílovému antigenu. Druhý krok IIF zahrnuje použití fluorescenčně značené sekundární protilátky, která je namířena proti Fc části primární protilátky.

Ačkoli je IIF považován za složitější než DIF, protože trvá déle a vyžaduje použití dvou kompatibilních protilátek, je lepší, pokud jde o schopnost citlivosti.

Mezi běžné klinické aplikace testů IFA patří testy používané k diagnostice syfilis. Pro tento typ IFA testu se izolují buňky T. palladium, které byly předtím izolovány z výzkumného zvířete, a umístí se na povrch skleněného sklíčka. Na buňky T. palladium se poté nanese sérum, které bylo získáno od pacienta, aby se na fixované antigeny mohly navázat antitreponemové protilátky, pokud jsou přítomny.

Po smytí vzorku séra pacienta se přidá sekundární protilátka, která byla označena fluoroforem. Pozitivní výsledek syfilis osvětlí všechny komplexy konjugátu sekundární protilátky a fluoroforu.

Dalším typem IFA, který je široce používán v klinických podmínkách, je ten, který se používá pro diagnostiku systémového lupus erythematodes (SLE). Pacienti se SLE, což je autoimunitní onemocnění, budou mít zvýšenou hladinu cirkulujících antinukleárních autoprotilátek (ANA), které jsou namířeny jak proti DNA, tak proti různým proteinům, které se vážou na DNA.

Pro tento typ IFA testu jsou buňky kultivovány a poté umístěny na skleněné sklíčko. Každé sklíčko se inkubuje s jinou koncentrací protilátky pacienta, která se následně promyje, aby se odstranily všechny nenavázané proteiny.

Po promytí se na sklíčka přidá fluorescenčně značená sekundární protilátka, což bude v případě testu ANA antihumánní IgG, a nechá se inkubovat. Titr ANA v séru se pak získá z nejvyššího ředění séra, které vykazovalo fluorescenci, a použije se ke stanovení diagnózy SLE.

Průtoková cytometrie

Třetí typ techniky fluorescenčních protilátek zahrnuje průtokovou cytometrii, což je automatizovaný systém počítání buněk, který lze použít ke kvantifikaci specifických buněk, které jsou přítomny v komplexních směsích, jako je krev nebo sérum.

Typický experiment průtokové cytometrie začíná inkubací fluorescenčně značené protilátky, která je namířena proti specifické subpopulaci buněk, jako je anti-CD4, která se může vázat na glykoprotein CD4 nacházející se na povrchu různých imunitních buněk včetně pomocných T-buněk, monocytů a makrofágů. Průtoková cytometrie může také kvantifikovat přítomnost více typů buněk pomocí vhodných buněčných maker.

Po ukončení inkubace se vzorek vloží do průtokového cytometru. V tomto zařízení nutí úzká kapilára buňky přítomné ve vzorku, aby se pohybovaly v jednom souboru. Jak se buňky pohybují kapilárou, laser se používá k aktivaci a excitaci všech buněk, které byly označeny fluoroforem.

Intenzita fluorescence každé excitované buňky se pak měří pomocí detektorů přímého i bočního rozptylu a zobrazuje se na histogramu pro analýzu. Kromě kvantifikačních účelů lze průtokovou cytometrii i imunofluorescenci použít k třídění buněk do purifikovaných subpopulací pro výzkumné účely pomocí techniky známé jako fluorescencí aktivovaný buněčný sorter (FACS).

• Odell, I. D., & Cook, D. (2013). Imunofluorescenční techniky. Journal of Investigative Dermatology 133. doi:10.1038/jid.2012.455.
• Parker, N., Schneegurt, M., Tu, A. T., et al. (2016). Kapitola 20.5 Techniky fluorescenčních protilátek. In: Sborník příspěvků k problematice fluorescenčních fluorescenčních mikroskopů: Microbiology. Dostupné z https://openstax.org/books/microbiology/pages/20-5-fluorescent-antibody-techniques.
• Betterle, C., & Zanchetta, R. (2012). Imunofluorescenční techniky v diagnostice endokrinních autoimunitních onemocnění. Autoimmunity Highlights 3(2); 67-78. doi:10.1007/s13317-012-0034-3.

Další čtení

• Všechny protilátky Obsah
• VHH protilátky (nanotělesa) Výhody a omezení
• Výběr protilátek pomocí lešení DNA Origami
• Využití protilátek proti histonové deacetyláze (HDAC) ve Výzkum
• Využití protilátek pro výzkum Parkinsonovy choroby

Napsal

Benedette Cuffari

Po dokončení bakalářského studia toxikologie s dvěma vedlejšími obory španělština a chemie v roce 2016, Benedette pokračovala ve studiu a v květnu 2018 dokončila magisterské studium toxikologie. Během postgraduálního studia Benedette zkoumala dermatotoxicitu mechlorethaminu a bendamustinu; dvou dusíkatých hořčičných alkylačních látek, které se používají v protinádorové terapii.

Citace

.