Stage II colon cancer

Úvod

Kolorektální karcinom (CRC) je třetím nejčastějším nádorovým onemocněním v západním světě, v roce 2010 bylo v USA diagnostikováno přibližně 142 570 případů (databáze SEER: http://seer.cancer.gov). Na celém světě je každoročně diagnostikováno přibližně 1,23 milionu nových případů a v roce 2008 došlo k 608 000 úmrtí na CRC (1). Celkově je jedna čtvrtina incidenčních případů ve stadiu II, což znamená, že nádor pronikl do svaloviny (T3) a může invadovat do přilehlých orgánů (T4), ale nerozšířil se do drenážních lymfatických uzlin nebo vzdálených míst (tabulka 1). Tento podíl se však liší podle místa nádoru, neboť téměř třetina karcinomů tlustého střeva je ve stadiu II ve srovnání s o něco více než pětinou karcinomů konečníku (databáze SEER: http://seer.cancer.gov). CRC ve stadiu II je klinicky i biologicky heterogenní onemocnění. Například riziko recidivy po resekci mikrosatelitově nestabilní léze T3 může být menší než 10 %, zatímco u pacienta, který podstoupí operaci nádoru T4 s proficientní mismatch repair, může být riziko recidivy onemocnění vyšší než 50 %. Nadměrné zastoupení mikrosatelitové nestability u nádorů stadia II ve srovnání s CRC celkově rovněž ilustruje variabilitu biologie CRC v různých stadiích onemocnění. Vzhledem k této heterogenitě nepřekvapuje, že přínos adjuvantní chemoterapie u CRC stadia II se značně liší v závislosti na klasických histopatologických a molekulárních vlastnostech nádoru.

Tabulka 1 Staging kolorektálního karcinomu
Plná tabulka

V tomto přehledu předkládáme aktualizovaný souhrn informací o diagnostice a stagingu, patologické analýze a terapeutickém postupu u CRC stadia II. Omezujeme se na nádory tlustého střeva (přibližně dvě třetiny z celkového počtu), protože léčba karcinomů rekta se podstatně liší a je rozebrána na jiném místě tohoto čísla. Kromě poskytnutí přehledu o nádorech tlustého střeva II. stadia se zaměřujeme zejména na vyvíjející se úlohu biomarkerů při předpovídání rizika recidivy a při rozhodování o adjuvantní léčbě.

Diagnostika a staging CRC

Při absenci screeningu je CRC obvykle diagnostikován na základě příznaků primárního nádoru nebo metastáz. Populační analýzy ukázaly, že přibližně čtvrtina všech kolorektálních karcinomů v nescreeningové populaci je ve stadiu II. Je zajímavé, že ačkoli by se dalo předpokládat, že zavedení screeningu povede ke zvýšení podílu nádorů stadia II, v několika screeningových studiích (1-3) se tak nestalo a migrace stadií po zavedení testování okultní krve ve stolici se projevila především nárůstem stadia I a snížením stadia IV. Z toho vyplývá, že plošné zavedení screeningu nemusí vést k podstatné změně četnosti výskytu CRC ve stadiu II.

Zatímco chirurgická resekce většiny nádorů tlustého střeva ve stadiu II otevřenou nebo laparoskopickou operací je jednoduchá, řešení nádorů T4 zasahujících do přilehlých struktur je náročnější. Úloha zobrazovacích metod při predikci resekability se v posledních letech značně vyvinula a na našem pracovišti se zvažuje použití předoperační chemoterapie s cílem usnadnit operaci u pacientů s pokročilými lézemi T4.

Po resekci je pro potvrzení diagnózy onemocnění ve stadiu II nezbytné přesné patologické hodnocení, přičemž konsenzuální doporučení doporučují vyšetření minimálně 12 lymfatických uzlin (4), ačkoli důkazy naznačují, že prognóza onemocnění ve stadiu II se zlepšuje v závislosti na počtu analyzovaných uzlin – což naznačuje, že část pacientů s okultními uzlinovými metastázami je podhodnocena v důsledku suboptimálního patologického hodnocení (5-8). Rozsah nádorové invaze je rovněž zásadní pro určení dalšího postupu, stejně jako přítomnost či nepřítomnost mikrosatelitní nestability (MSI) (popsáno níže). Dalšími patologickými znaky, u nichž se běžně předpokládá, že mají prognostický význam, ale v některých případech nejsou potvrzeny, jsou vaskulární invaze nádoru a grade. Ačkoli jsou v každodenní praxi často považovány za samozřejmost, role patologa při určování těchto faktorů má zásadní význam pro informování následného managementu pacienta.

Biologie II. stadia karcinomu tlustého střeva

Přestože existují společné rysy s ostatními stadii CRC, existují také pozoruhodné rozdíly mezi II. stadiem karcinomu tlustého střeva a ostatními stadii onemocnění. Nejznámějším z nich je vysoká frekvence MSI u karcinomu tlustého střeva stadia II, která je přítomna v 15 % případů celkově a přibližně ve 25 % pravostranných nádorů, ve srovnání s frekvencí 14 u karcinomu tlustého střeva stadia III a 4 % u metastatického onemocnění (9). Proteiny opravující neshody jsou nezbytné pro dohled nad nově syntetizovaným vláknem DNA po replikaci, kde slouží k rozpoznávání chybně spárovaných bází, malých inzertů a delecí inkorporovaných DNA polymerázami (10). Zárodečná mutace genů pro opravu chyb MLH1, MSH2, MSH6 nebo PMS2 způsobuje Lynchův syndrom (známý také jako hereditární nepolypózní kolorektální karcinom – HNPCC), který je kromě nádorů vaječníků, žaludku, tenkého střeva, slinivky břišní a dalších míst spojen s časným vznikem karcinomu tlustého střeva a endometria (11,12). Defektní funkce mismatch repair u sporadického karcinomu tlustého střeva je obvykle způsobena mutací MSH6, MSH2 nebo epigenetickým umlčením MLH1 metylací promotoru (12). U dědičných i sporadických nádorů vede aberantní funkce mismatch repair k neopravování defektů způsobených skluzem DNA polymeráz na mikrosatelitech – krátkých tandemových repeticích DNA – a bodovými mutacemi, což vede k charakteristickému molekulárnímu fenotypu mikrosatelitní nestability (MSI) a mutacím nádorových supresorů TGFβR2, IGF2R, BAX a PTEN a onkogenu BRAF (12-15). Nádory s vysokým MSI jsou obvykle proximálně od slezinné flexury, jsou špatně diferencované a vykazují výrazný lymfocytární infiltrát (12). Potvrzení mikrosatelitové nestability nádoru lze provést buď pomocí PCR – průkazem nestability alespoň 2 z 5 vyšetřovaných mikrosatelitových markerů – nebo pomocí imunohistochemie (IHC) na proteiny mismatch repair, neboť chybějící barvení vykazuje vynikající shodu s MSI-high statusem (16,17). Vyšetření MSI u karcinomu tlustého střeva ve stadiu II, a zejména u nádorů T3, se doporučuje, protože má důležité prognostické a terapeutické důsledky, jak je uvedeno níže.

Adjuvantní chemoterapie u karcinomu tlustého střeva ve stadiu II

Ačkoli přínos adjuvantní chemoterapie 5-fluorouracilem (FU) po resekci onemocnění ve stadiu III je dobře znám již více než dvě desetiletí, úloha pooperační chemoterapie u onemocnění ve stadiu II zůstávala nejasná až do zveřejnění studie QUASAR. Tato studie randomizovala 3 239 pacientů po resekci CRC, z nichž 90 % mělo onemocnění ve stadiu II, k adjuvantní chemoterapii s FU a kyselinou folinovou (n = 1 622) nebo k pozorování (n = 1 617). Po průměrné době sledování 5,5 roku byla míra recidivy v rameni s chemoterapií o 20 % nižší než v rameni s pozorováním, což znamená absolutní snížení rizika recidivy o 3,6 % (P=0,04) (18). Tento jednoznačný důkaz přínosu adjuvantní chemoterapie u karcinomu tlustého střeva ve stadiu II je podpořen dalšími analýzami (19-22) a znamená, že po operaci je nezbytné s vhodnými pacienty vést informovanou diskusi o rizicích a přínosech léčby. Studie MOSAIC prokázala, že přidání oxaliplatiny k FU zlepšuje přežití bez recidivy po operaci u onemocnění ve stadiu III, i když za cenu vyšší toxicity (23). Následné údaje z této studie však ukazují, že ačkoli se to promítlo do přínosu kombinované léčby pro přežití po 6 letech u onemocnění stadia III, u karcinomů stadia II se žádná výhoda neprojevila (24). V důsledku toho nelze oxaliplatinu rutinně doporučit k použití jako adjuvantní léčbu u karcinomu tlustého střeva ve stadiu II.

Biomarkery u CRC ve stadiu II

Vzhledem ke skromnému celkovému přínosu adjuvantní chemoterapie u karcinomu tlustého střeva ve stadiu II byly učiněny pokusy omezit její použití na pacienty s vysoce rizikovým onemocněním za předpokladu, že tito pacienti budou mít z léčby největší prospěch. Kritéria používaná k určení „špatných prognostických faktorů“ – primární nádor T4, vysoký grade, lymfovaskulární invaze atd. – byla většinou určena retrospektivní analýzou podskupin, a přestože prognostický význam primárního nádoru T4 je dobře znám (25), většina ostatních faktorů nebyla prospektivně ověřena. Když se zamyslíme nad kvalitou podkladových údajů, je skutečně s podivem, že se některé takové znaky prosadily v klinické praxi a byly zahrnuty do pokynů pro léčbu onemocnění ve stadiu II. Nedávné vysoce kvalitní údaje z molekulární analýzy velkých prospektivních klinických studií však jasně prokázaly prognostický význam nádorové mikrosatelitní nestability a naznačily, že analýza profilů genové exprese nádoru může v některých případech karcinomu tlustého střeva pomoci při rozhodování o léčbě.

Prognostický význam mikrosatelitní nestability (MSI)

Ačkoli prognostický význam MSI byl dříve nejasný, údaje z několika velkých randomizovaných klinických studií (RCT) (9,26-30) a metaanalýza (31) přesvědčivě prokázaly, že přítomnost nádorové MSI je spojena s příznivým výsledkem. Metaanalýza 7 642 pacientů, z nichž 1 277 mělo nádory s MSI, ukázala poměr rizika úmrtí 0,65 (95% CI, 0,59 až 0,71) u pacientů s nádory s MSI ve srovnání s pacienty s mikrosatelitově stabilním (MSS) onemocněním (31). I když pomineme domněnku, že MSI může předpovídat nedostatečný přínos adjuvantní chemoterapie (31), pacienti s primárním T3 a MSI nádoru mají dostatečně nízké riziko recidivy, což znamená, že jakýkoli přínos pooperační chemoterapie je minimální, a tito pacienti proto mohou být léčby ušetřeni. Zajímavé je, že kombinace primárního nádoru T4 a MSI je vzácná – přibližně 2 % případů karcinomu tlustého střeva ve stadiu II – a zdá se, že má podobnou prognózu jako onemocnění s primárním nádorem T3 a MSS, i když v tomto odhadu existuje velká míra nejistoty. V důsledku toho by se u pacientů této skupiny měla zvážit adjuvantní chemoterapie. Mechanismy, které stojí za příznivým výsledkem rakoviny s vysokým MSI, jsou v současné době nejasné, ale mohou být způsobeny a protinádorovou imunitní odpovědí (32) nebo sníženou životaschopností spojenou s hypermutací v nádorech (33). Údaje o užitečnosti adjuvantní chemoterapie u většiny pacientů (85 %) s nádory s MSS nejsou dostatečně silné, aby změnily odhadovaný přínos studie QUASAR (18). Navrhovaný algoritmus léčby zohledňující stadium nádoru a stav mismatch repair je uveden na obrázku 1.

Obrázek 1 Navrhovaný algoritmus léčby karcinomu tlustého střeva ve stadiu II. Algoritmus zahrnuje konvenční a molekulární prognostické znaky, podle kterých se řídí léčba. Pacienti s primárním nádorem T4 mají vysoké riziko recidivy a měla by u nich být zvážena adjuvantní chemoterapie. Pacienti s primárním nádorem T3 a mikrosatelitní nestabilitou nádoru (MSI) mají vynikající prognózu a mohou být léčby ušetřeni. Pacienti s primárním nádorem T3 s mikrosatelitovou stabilitou jsou kandidáty na skóre recidivy, které umožňuje předpovědět riziko recidivy a pravděpodobný přínos chemoterapie

Prognostické genové signatury

V rámci snahy zlepšit využitelnost konvenčních klinicko-patologických znaků pro prognózu u karcinomu tlustého střeva II. stadia vznikla transatlantická spolupráce mezi zkušebními skupinami QUASAR a NSABP, Cleveland Clinic a Genomic Health. Cílem této spolupráce bylo zjistit, zda by hladiny exprese nádorové RNA mohly sloužit ke zlepšení konvenčních parametrů pro klasifikaci rizika recidivy. Vývojová studie zahrnovala 1 851 pacientů zařazených do klinických studií NSABP C-01/C-02/C-04/C-06 a kohortu neléčených pacientů z Clevelandské kliniky (34). RNA byla extrahována z nádorových bloků fixovaných formalínem a zalitých do parafínu (FFPE) a genová exprese byla kvantifikována pomocí RT-PCR. Multivariační analýza korelace exprese 761 kandidátních genů na přežití bez recidivy (RFS), přežití bez nemoci (DFS) a celkové přežití (OS) upravená podle stadia, grade, počtu vyšetřených lymfatických uzlin a stavu MSI poskytla 18 informativních genů (7 prognostických genů, 6 genů predikujících přínos FU a 5 vnitřních referenčních genů pro normalizaci), které byly použity k vytvoření samostatných prognostických skóre recidivy a skóre prediktivní léčby. Užitečnost těchto skóre genové exprese byla poté zkoumána u 1 436 pacientů s mediánem sledování 6,6 roku ze studie QUASAR (35). V univariační analýze skóre recidivy předpovídalo riziko recidivy (poměr rizik/25 jednotek =1,58; 95% CI, 1,15 až 2,15; P=0,004), DFS (P=0,01) a OS (P=0,04). Riziko recidivy se zvyšovalo se zvyšujícím se skóre recidivy, přičemž tříleté recidivy činily 12, 18 a 22 % v předem definovaných skupinách s nízkým, středním a vysokým rizikem recidivy (obrázek 2). V multivariačních analýzách si skóre recidivy zachovalo prognostický význam (P=0,008) po úpravě na primární stadium nádoru, počet vyšetřených lymfatických uzlin, stav MSI, grade nádoru a lymfovaskulární invazi nádoru. Skóre léčby však nepředpovídalo přínos chemoterapie (P=0,19) (35). Kontinuální skóre recidivy je tedy schopno zlepšit hodnocení rizika recidivy a může být užitečné zejména pro většinu (76 %) případů karcinomu tlustého střeva ve stadiu II s nádory T3 MSS, jak je znázorněno na obrázku 2. V této skupině lze skóre recidivy použít k rozdělení pacientů s velmi nízkým rizikem recidivy, u nichž je absolutní přínos chemoterapie příliš malý na to, aby bylo možné doporučit její použití, a pacientů s vyšším rizikem, u nichž je 25-30% riziko recidivy spojeno s větším absolutním přínosem adjuvantní léčby – možná o 5-6 procentních bodů. Ve skupině se středním rizikem lze vést informovanější diskusi mezi pacientkou a lékařem o pravděpodobném přínosu adjuvantní chemoterapie, než je v současnosti možné. Výhodou skóre recidivy je použití běžného patologického materiálu na rozdíl od alternativ, které vyžadují zmrazenou tkáň – ta se v každodenní klinické praxi rutinně neodebírá. Doufáme, že v budoucnu poskytne vylepšené prediktivní skóre prospěšnosti chemoterapie další informace, které bude možné využít při rozhodování o léčbě pacientů s karcinomem tlustého střeva ve stadiu II.

Obrázek 2 Riziko recidivy karcinomu tlustého střeva ve stadiu II ve studii QUASAR podle stadia nádoru a skóre recidivy. Skóre recidivy, stadium T a MSI nádoru jsou nezávislými prediktory rizika recidivy. Případy karcinomů T4, MSI-high byly vzácné (2 % všech pacientů) a měly odhadované riziko recidivy přibližně stejné jako nádory T3, MSS (s velkými intervaly spolehlivosti) a nejsou v tomto obrázku zahrnuty

Závěry

Přibližně čtvrtina pacientů s kolorektálním karcinomem má onemocnění ve stadiu II a v této skupině existují značné rozdíly v klinicko-patologických vlastnostech, molekulární biologii a výsledcích jednotlivých případů. Prognóza se liší od vynikajícího výsledku spojeného s primárním nádorem MSI T3 až po riziko recidivy >50 % u primárního nádoru MSS T4, který se projevuje střevní obstrukcí. V důsledku toho, jak jsme se snažili zdůraznit v tomto přehledu, nelze doporučit univerzální přístup a rozhodnutí o léčbě musí být individuální, přinejmenším na základě stadia nádoru a stavu MSI. V části případů může skóre recidivy poskytnout další informace o riziku recidivy než samotné konvenční klinicko-patologické znaky a pomoci při rozhodování. Probíhající studie by měly objasnit úlohu dalších molekulárních markerů při hodnocení prognózy a pravděpodobnosti přínosu chemoterapie.

Poděkování

Zveřejnění: Dr. Rachel Midgleyová získává finanční prostředky na výzkum od společnosti Genomic Health v souvislosti s projektem hledajícím potenciální podpis genové exprese jako marker terapeutické účinnosti. S vděčností děkuje za podporu od DH a HEFCE (UK) ve formě osobního stipendia a od Oxford Biomedical Research Council (BMRC). Dr. Church děkuje za podporu oxfordské BMRC. Profesor David Kerr dříve obdržel finanční prostředky na výzkum od společnosti Genomic Health s ohledem na projekt ověřující podpis genové exprese pro prognózu kolorektálního karcinomu.

1. Gill MD, Bramble MG, Rees CJ, et al. Comparison of screen-detected and interval colorectal cancers in the Bowel Cancer Screening Programme. Br J Cancer 2012;107:417-21.
2. Hardcastle JD, Chamberlain JO, Robinson MH, et al. Randomised controlled trial of faecal-occult-blood screening for colorectal cancer. Lancet 1996;348:1472-7.
3. Faivre J, Dancourt V, Lejeune C, et al. Reduction in colorectal cancer mortality by fecal occult blood screening in a French controlled study. Gastroenterology 2004;126:1674-80.
4. Nelson H, Petrelli N, Carlin A, et al. Guidelines 2000 for colon and rectal cancer surgery. J Natl Cancer Inst 2001;93:583-96.
5. Choi HK, Law WL, Poon JT. The optimal number of lymph nodes examined in stage II colorectal cancer and its impact of on outcomes [Optimální počet vyšetřených lymfatických uzlin u II. stadia kolorektálního karcinomu a jeho vliv na výsledky]. BMC Cancer 2010;10:267.
6. Tepper JE, O’Connell MJ, Niedzwiecki D, et al. Impact of number of nodes retrieved on outcome in patients with rectal cancer. J Clin Oncol 2001;19:157-63.
7. Swanson RS, Compton CC, Stewart AK, et al. The prognosis of T3N0 colon cancer is dependent on the number of lymph nodes examined. Ann Surg Oncol 2003;10:65-71.
8. Tsai HL, Lu CY, Hsieh JS, et al. The prognostic significance of total lymph node harvest in patients with T2-4N0M0 colorectal cancer. J Gastrointest Surg 2007;11:660-5.
9. Bertagnolli MM, Redston M, Compton CC, et al. Microsatellite instability and loss of heterozygosity at chromosomal location 18q: prospective evaluation of biomarkers for stages II and III colon cancer–a study of CALGB 9581 and 89803. J Clin Oncol 2011;29:3153-62.
10. Kunkel TA, Erie DA. DNA mismatch repair. Annu Rev Biochem 2005;74:681-710.
11. Lynch HT, Boland CR, Gong G, et al. Phenotypic and genotypic heterogeneity in the Lynch syndrome: diagnostic, surveillance and management implications. Eur J Hum Genet 2006;14:390-402.
12. Boland CR, Goel A. Microsatellite instability in colorectal cancer. Gastroenterology 2010;138:2073-2087.e3.
13. Ionov Y, Peinado MA, Malkhosyan S, et al. Ubiquitous somatic mutations in simple repeated sequences reveal a new mechanism for colon carcinogenesis. Nature 1993;363:558-61.
14. Rampino N, Yamamoto H, Ionov Y, et al. Somatické frameshift mutace v genu BAX u karcinomů tlustého střeva s fenotypem mikrosatelitního mutátora. Science 1997;275:967-9.
15. Thibodeau SN, Bren G, Schaid D. Microsatellite instability in cancer of the proximal colon. Science 1993;260:816-9.
16. Boland CR, Thibodeau SN, Hamilton SR, et al. A National Cancer Institute Workshop on Microsatellite Instability for cancer detection and familial predisposition: Development of international criteria for the determination of microsatellite instability in colorectal cancer. Cancer Res 1998;58:5248-57.
17. Lindor NM, Burgart LJ, Leontovich O, et al. Immunohistochemistry versus microsatellite instability testing in phenotyping colorectal tumors. J Clin Oncol 2002;20:1043-8.
18. Quasar Collaborative Group, Gray R, Barnwell J, et al. Adjuvantní chemoterapie versus pozorování u pacientů s kolorektálním karcinomem: randomizovaná studie. Lancet 2007;370:2020-9.
19. Účinnost adjuvantní léčby fluorouracilem a kyselinou folinovou u karcinomu tlustého střeva B2. International Multicentre Pooled Analysis of B2 Colon Cancer Trials (IMPACT B2) Investigators. J Clin Oncol 1999;17:1356-63.
20. Figueredo A, Charette ML, Maroun J, et al. Adjuvantní léčba karcinomu tlustého střeva ve stadiu II: systematický přehled od skupiny Cancer Care Ontario Program in evidence-based care’s gastrointestinal cancer disease site group. J Clin Oncol 2004;22:3395-407.
21. Gill S, Loprinzi CL, Sargent DJ, et al. Pooled analysis of fluorouracil-based adjuvant therapy for stage II and III colon cancer: who benefits and by how much? J Clin Oncol 2004;22:1797-806.
22. Mamounas E, Wieand S, Wolmark N, et al. Comparative efficacy of adjuvant chemotherapy in patients with Dukes‘ B versus Dukes‘ C colon cancer: results from four National Surgical Adjuvant Breast and Bowel Project adjuvant studies (C-01, C-02, C-03, and C-04). J Clin Oncol 1999;17:1349-55.
23. André T, Boni C, Mounedji-Boudiaf L, et al. Oxaliplatina, fluorouracil a leukovorin jako adjuvantní léčba karcinomu tlustého střeva. N Engl J Med 2004;350:2343-51.
24. André T, Boni C, Navarro M, et al. Improved overall survival with oxaliplatin, fluorouracil, and leucovorin as adjuvant treatment in stage II or III colon cancer in the MOSAIC trial. J Clin Oncol 2009;27:3109-16.
25. O’Connell JB, Maggard MA, Ko CY. Míra přežití karcinomu tlustého střeva podle nového stagingu šestého vydání American Joint Committee on Cancer. J Natl Cancer Inst 2004;96:1420-5.
26. Roth AD, Tejpar S, Delorenzi M, et al. Prognostická role KRAS a BRAF u resekovaného karcinomu tlustého střeva stadia II a III: výsledky translační studie na základě studie PETACC-3, EORTC 40993, SAKK 60-00. J Clin Oncol 2010;28:466-74.
27. Roth AD, Delorenzi M, Tejpar S, et al. Integrated analysis of molecular and clinical prognostic factors in stage II/III colon cancer. J Natl Cancer Inst 2012;104:1635-46.
28. Halling KC, French AJ, McDonnell SK, et al. Microsatellite instability and 8p allelic imbalance in stage B2 and C colorectal cancer. J Natl Cancer Inst 1999;91:1295-303.
29. Sinicrope FA, Rego RL, Halling KC, et al. Prognostický dopad mikrosatelitní nestability a ploidie DNA u pacientů s karcinomem tlustého střeva. Gastroenterology 2006;131:729-37.
30. Watanabe T, Wu TT, Catalano PJ, et al. Molekulární prediktory přežití po adjuvantní chemoterapii karcinomu tlustého střeva. N Engl J Med 2001;344:1196-206.
31. Popat S, Hubner R, Houlston RS. Systematický přehled mikrosatelitní nestability a prognózy kolorektálního karcinomu. J Clin Oncol 2005;23:609-18.
32. Dolcetti R, Viel A, Doglioni C, et al. High prevalence of activated intraepithelial cytotoxic T lymphocytes and increased neoplastic cell apoptosis in colorectal carcinomas with microsatellite instability. Am J Pathol 1999;154:1805-13.
33. Sankila R, Aaltonen LA, Järvinen HJ, et al. Lepší přežití u pacientů s dědičným kolorektálním karcinomem asociovaným s MLH1. Gastroenterology 1996;110:682-7.
34. O’Connell MJ, Lavery I, Yothers G, et al. Vztah mezi expresí nádorových genů a recidivou ve čtyřech nezávislých studiích pacientů s karcinomem tlustého střeva ve stadiu II/III léčených samotnou operací nebo operací plus adjuvantním fluorouracilem plus leukovorinem. J Clin Oncol 2010;28:3937-44.
35. Gray RG, Quirke P, Handley K, et al. Validation study of a quantitative multigene reverse transcriptase-polymerase chain reaction assay for assessment of recurrence risk in patients with stage II colon cancer. J Clin Oncol 2011;29:4611-9.

.