Materiál a metody
Účastníci
Subjektem bylo 83 dětí s ADHD (75 % chlapců) a 72 dětí s TD (51 % chlapců) ve věku od 6 do 13 let. Kritéria pro zařazení do skupiny s ADHD byla následující: (a) klinická diagnóza ADHD podle kritérií DSM-IV, (b) potvrzení této diagnózy pomocí dotazníku Diagnostic Interview Schedule for Children, fourth edition, podávaného rodičům (DISC-IV-P; ), (c) výrazné příznaky ADHD, jak ukazují hodnocení rodičů >90. percentil na alespoň jedné ze škál ADHD (škála nepozornosti a škála hyperaktivity/impulzivity) škály pro hodnocení poruch narušeného chování (DBDRS; ), a (d) pervazivní příznaky ADHD, jak ukazují hodnocení učitelů >75. percentil na alespoň jedné ze škál ADHD DBDRS. Existence komorbidní diagnózy (například ODD nebo ASD) nebyla vylučujícím kritériem, stejně jako léčba stimulačními léky. Děti užívající stimulační léky (N = 50, 60 % ze skupiny ADHD) přerušily užívání léků 24 hodin před testováním, aby došlo k úplnému vymývání , a během účasti v naší studii. Kritéria pro zařazení do skupiny TD byla následující: (a) nepřítomnost klinické diagnózy jakékoli vývojové poruchy nebo poruchy chování (včetně ADHD a ODD) a (b) skóre <90. percentil na škále ADHD DBDRS hodnocené rodiči i učitelem.
Materiály
Chování.
Rodiče dětí vhodných pro zařazení do skupiny ADHD byli hodnoceni pomocí oddílu DISC-IV-P zaměřeného na poruchy chování. DISC-IV-P je široce používaný standardizovaný diagnostický rozhovor pro hodnocení dětských psychiatrických poruch podle DSM-IV s odpovídajícími psychometrickými vlastnostmi .
Rodiče a učitelé dětí ve skupině ADHD i TD vyplnili DBDRS pro hodnocení příznaků ADHD a příznaků ODD a CD. DBDRS obsahuje čtyři škály měřící příznaky nepozornosti, hyperaktivity/impulzivity, ODD a CD na čtyřbodové Likertově škále (od 0 do 3), přičemž vyšší skóre znamená horší příznaky. Pro DBDRS byly zjištěny odpovídající psychometrické vlastnosti .
Škála hodnocení silných a slabých stránek ADHD – příznaky a normální chování (SWAN; ) byla vyplněna rodiči a učiteli za účelem posouzení příznaků ADHD. Tento široce používaný dotazník obsahuje dvě dílčí škály: škálu nepozornosti a škálu hyperaktivity/impulzivity, z nichž každá obsahuje 9 položek. Položky jsou hodnoceny na sedmibodové Likertově škále (v rozmezí -3 až +3), přičemž vyšší skóre znamená horší příznaky. Položky vycházejí z příznaků ADHD podle DSM-IV, ale odrážejí oba konce (silný i slabý) chování popsaného v jednotlivých příznacích ADHD. Jako závislé proměnné byly použity průměrné skóre obou subškál. Pro SWAN byly zjištěny odpovídající psychometrické vlastnosti .
Příznaky ADHD byly hodnoceny pomocí 65položkové škály sociální citlivosti (SRS; ), kterou vyplňovali rodiče a učitelé. Položky SRS vycházejí z domén příznaků poruchy autistického spektra podle DSM-IV, včetně poruchy sociální interakce, komunikačních deficitů a omezených/stereotypních vzorců chování nebo zájmů. SRS používá čtyřbodovou Likertovu škálu (od 0 do 3) a jako závislé měřítko bylo použito součtové skóre položek na celkové škále SRS, přičemž vyšší skóre znamená horší příznaky. SRS má odpovídající psychometrické vlastnosti .
Krevní skvrny.
K vyšetření koncentrace tryptofanu, tyrozinu a fenylalaninu v krvi byla použita technika sušených krevních skvrn. Odběr krevních skvrn je pro děti méně invazivní než odběr vzorků žilní krve a technika sušených krevních skvrn je dostatečně robustní a stabilní pro diagnostické účely . Koncentrace AAA v krevních skvrnách vysoce korelují s koncentracemi AAA v séru (rs v rozmezí .86 až .96) . Každému dítěti byl odebrán krevní vzorek pomocí jednorázové bezpečnostní lancety. Tři kapky krve byly naneseny na kartu s krevními skvrnami. 5,5mm vpich zaschlé krevní skvrny byl smíchán se 100 μl roztoku vnitřního standardu (obsahujícího 29 μM L-fenylalaninu-D5, 6 μM L-tyrosinu-D4 a 5 μM L-tryptofanu-D5) a 400 μl methanolu v lahvičce pro plynovou chromatografii (GC-vial) a třepán 15 minut v ultrazvukové lázni. Supernatant byl převeden do jiné GC-vialky a odpařen pod dusíkem při 30 °C. Následně byl vzorek butylován 100 μl 5,5% acetylchloridu (v n-butanolu) při 60 °C po dobu 15 minut. Poté byla butanolová vrstva odpařena pod dusíkem (při 30 °C) a zbytek byl rozpuštěn v 500 μl acetonitrilu. Koncentrace tryptofanu, tyrosinu a fenylalaninu v krevních skvrnách byly stanoveny pomocí pozitivní elektrosprejové kapalinové chromatografie-tandemové hmotnostní spektrometrie (LC-MS/MS) s použitím trojitého kvadrupólového hmotnostního spektrometru API 3000 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA), spojeného se systémem vysokoúčinné kapalinové chromatografie (HPLC) (Perkin Elmer Series 200, Shelton, USA). Tři μl vzorku byly vstříknuty na symetrickou kolonu C18 (3,9*150 mm, 5 μm; Waters, Milford, MA, USA) a eluovány průtokem 75 % acetonitrilu (obsahujícího 0,4 % kyseliny mravenčí) o rychlosti 1 ml/min. Tryptofan, tyrosin a fenylalanin se eluovaly během 1 minuty a měřily se pomocí přechodů: poměr hmotnosti a náboje (m/z) 261,2→159,2 (tryptofan), m/z 238,2→136,2 (tyrosin) a m/z 222,2→120,2 (fenylalanin). Všechna získaná LC-MS/MS data byla získána a zpracována pomocí softwaru Analyst 1.4.2 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Koncentrace tryptofanu, tyrosinu a fenylalaninu v krevním vzorku byly vyjádřeny v μmol/l. Spolehlivost LC-MS/MS byla potvrzena zkoumáním inter-assay rozptylu (činil 5-10 %), intra-assay rozptylu (činil 8-10 %) a výtěžnosti (činila 90-112 %).
Příjem bílkovin ve stravě.
Denní příjem bílkovin byl hodnocen během tří dnů pomocí výživového deníku vedeného rodiči. Byly poskytnuty standardizované záznamy o stravě a pokyny. Rodiče byli poučeni, aby do stravovacích záznamů zaznamenávali všechny zkonzumované potraviny a nápoje a aby co nejpřesněji vyjadřovali zkonzumované množství. Množství přijatých bílkovin (v gramech/den) bylo vypočteno na základě počítačové verze nizozemské databáze složení potravin . Nizozemská databáze složení potravin obsahuje více než 2000 potravin s informacemi o nutričním složení těchto potravin . Databáze je široce využívána pro vědecké účely (např.).
Moč.
Za účelem vyšetření koncentrace AAA v moči účastníci sbírali veškerou moč vyloučenou během 18 po sobě jdoucích hodin (po vyučování) do sběrné nádoby na moč. Během sběru moči byla nádoba uložena v chladničce (<5 °C). Vzorek o objemu 10 ml byl odeslán k analýze do laboratoře, kde byl uchováván při teplotě -20 °C. Pro analýzu tryptofanu v moči byla použita technika HPLC s fluorescenční detekcí . Koncentrace tyrosinu a fenylalaninu v moči byly stanoveny pomocí analyzátoru aminokyselin Biochrom . Koncentrace tryptofanu, tyrosinu a fenylalaninu v moči byly vyjádřeny poměrem μmol k celkovému objemu moči, aby se vyloučil vliv polyurie nebo oligurie. Spolehlivost techniky HPLC byla potvrzena zkoumáním přesnosti analýz, která činila 2,25 % pro tryptofan (relativní směrodatná odchylka) a 1,50 % pro tyrosin a fenylalanin. Mezi koncentracemi aminokyselin ve 12hodinových a 24hodinových vzorcích existují vysoké korelace , což naznačuje, že ve vylučování aminokyselin neexistují žádné denní odchylky, což potvrzuje použití 18hodinového vzorku v této studii.
Postup
Tato studie byla schválena místní lékařskou etickou komisí VU University Medical Center Amsterdam, Nizozemsko (#NL39922.029.12), a byla provedena v souladu s etickými normami stanovenými v Helsinské deklaraci z roku 1964 a jejích pozdějších dodatcích. Před účastí byl získán písemný informovaný souhlas rodičů všech dětí a dětí ve věku ≥ 12 let. Děti s ADHD byly rekrutovány z psychiatrických ambulancí, prostřednictvím rodičovského sdružení pro děti s poruchami chování a prostřednictvím univerzitní výzkumné webové stránky. Skupina TD byla rekrutována ze základních škol rozmístěných po celé zemi. Děti užívající stimulační léky přerušily užívání léků jeden den před účastí (den 0), aby bylo zajištěno úplné vymývání, a během hodnocení příjmu krve, moči a potravy (den 1 až den 3). V den 1 byl krevní vzorek odebrán brzy ráno, aby se vyloučil vliv denního kolísání koncentrací AAA v krvi. Téhož dne po skončení vyučování byl zahájen sběr moči, který pokračoval po dobu následujících 18 hodin, dokud se dítě nevrátilo do školy následující den ráno (2. den). V časných ranních hodinách 1. dne dostali rodiče podrobné instrukce, jak vyplnit stravovací záznam a jak sbírat moč svého dítěte. Po instruktáži začali rodiče zapisovat příjem stravy svého dítěte, což pokračovalo po následující tři dny (1. až 3. den). Rodiče a učitelé byli vyzváni k vyplnění dotazníků na zabezpečených internetových stránkách. Všechny údaje byly shromážděny v období od února 2013 do července 2014. Skupina ADHD a TD byla rekrutována současně, aby bylo možné kontrolovat možné sezónní vlivy na příjem potravy nebo metabolismus AAA.
Analýza dat
Všechny statistické analýzy byly provedeny pomocí programu R, verze 3.2.1.
. Všechny proměnné byly kontrolovány na odlehlé hodnoty a chybějící hodnoty zvlášť pro skupinu ADHD a TD. Na odlehlé hodnoty byla použita metoda Winsorising, tyto byly nahrazeny hodnotou o jednu jednotku větší (nebo menší) než předchozí nejextrémnější skóre v rozdělení skupiny . Chybějící údaje v koncentracích moči, údaje o stravě a údaje o chování byly náhodně rozděleny a nahrazeny pomocí skupinových průměrů. U krevních skvrn nebyly žádné chybějící údaje. Všechny údaje byly normálně rozděleny, s výjimkou symptomů CD. Skupinové rozdíly v pohlaví byly zkoumány pomocí chí-kvadrát testu a skupinové rozdíly ve věku a chování byly zkoumány pomocí t-testů nezávislých vzorků.
Pro testování první hypotézy byly skupinové rozdíly v koncentracích AAA v krevních skvrnách hodnoceny pomocí analýz rozptylu (ANOVA) se skupinou (ADHD nebo TD) jako fixním faktorem. Velikost účinku byla vypočtena ve smyslu parciálního eta square a interpretována jako malá (> .01), střední (>.06) nebo velká (>.14) . Kromě toho byly vypočteny poměry šancí, které vyjadřovaly riziko diagnózy ADHD s podprůměrnou koncentrací AAA. Normativní údaje pro koncentrace AAA byly získány z velkého vzorku dětí ve věku 6 až 13 let (N = 104, 52 % chlapců) (nepublikované údaje, informace o vzorku a výsledky jsou k dispozici u autorů). Pro každý AAA byly jako prahová hodnota pro definování podprůměrných koncentrací AAA použity koncentrace odpovídající nejnižšímu 16. percentilu (M-1 SD) normativního vzorku (pro tryptofan 45 μmol/l, tyrosin 39 μmol/l a fenylalanin 47 μmol/l). Byly vypočteny poměry šancí s jejich 95% intervalem spolehlivosti a ke zkoumání významnosti poměrů šancí byl proveden Fisherův exaktní test.
K ověření druhé hypotézy byl pomocí Pearsonových korelačních koeficientů součinu a momentu zkoumán vztah mezi koncentracemi AAA v krevním vzorku a symptomy ADHD hodnocenými rodiči i učiteli. Velikost korelačních koeficientů byla interpretována jako malá (>,10), střední (>,30) nebo velká (>,50) . Údaje skupiny ADHD a skupiny TD byly sloučeny, aby se maximalizovala variabilita měření symptomů ADHD.
Pro ověření třetí hypotézy byly v celém vzorku provedeny korelační analýzy mezi koncentracemi AAA v krevním obraze a požitím bílkovin a koncentracemi AAA v moči. Zkoumali jsme také, zda existují skupinové rozdíly v požití bílkovin a koncentracích AAA v moči pomocí ANOVA se skupinou (ADHD nebo TD) jako fixním faktorem. Nakonec korelační analýzy hodnotily, zda koncentrace AAA v krevním obraze souvisí s příznaky komorbidních psychiatrických poruch uváděnými rodiči a učiteli (Pearsonovy korelační koeficienty součinu a momentu pro ODD a ASD, Spearmanovy korelační koeficienty pořadí pro CD). Pokud byla zjištěna souvislost symptomů ODD, CD nebo ASD s koncentracemi AAA, byly předchozí analýzy provedeny znovu s těmito symptomy zadanými jako kovariáty. Pro korekci vícenásobného testování byla hladina alfa korelačních analýz upravena podle Bonferroniho postupu pro každou oblast výsledků; symptomy ADHD (12 analýz, tedy p = .004), potenciální determinanty abnormalit AAA v krevních skvrnách (12 analýz, tedy p = .004) a symptomy komorbidních psychiatrických poruch (18 analýz, tedy p = .003). Uvádějí se výsledky upravené podle Bonferroniho.