Tato kapitola se vágně vztahuje k oddílu E(iv) osnovy CICM Primary 2017, který očekává, že kandidát zkoušky „popíše složení …nitrobuněčné tekutiny“. Protože se jedná o oddíl věnovaný buněčné fyziologii, bude zde kladen důraz především na mikroúroveň organizace a veškerá diskuse o intracelulárním kompartmentu tělních tekutin bude ponechána pro oddíl Tělesné tekutiny.
Skutečnost, že zkoušející na vysokých školách nikdy nezaměřili své oko na toto téma, dodává diskusi o něm téměř osvobozující atmosféru zbytečnosti, protože jak kandidáti zkoušky, tak autor si příjemně uvědomují, že každý z nich plýtvá časem toho druhého. Než aby zde člověk nasával tvrdou vědu a učil se nazpaměť zkoušená fakta, může si klidně číst dál z čistě meditativních důvodů nebo přeskočit k tématům, která přitahují více bodů.
Shrnutí:
- Obsah nitrobuněčné tekutiny má některé specifické strukturní vlastnosti:
- Malý objem, v průměru asi 2 pikolitry.
- Přeplněný, naplněný bílkovinami (20-30 % hmotnosti bílkovin).
- Většina vody je v adsorbované formě.
- To má specifické funkční a chemické výhody:
- Menší prostor znamená velkou šanci na molekulární interakce.
- Makromolekulární „přeplnění“ proteinů zvyšuje jejich tepelnou stabilitu, zvyšuje afinitu jejich interakcí a podporuje samouspořádání.
- Adsorbovaná voda má atypické vlastnosti rozpouštědla, které jsou nezbytné pro normální funkci enzymů.
- Intracelulární tekutina má zvláštní chemické složení a vlastnosti:
- Ionty v intracelulární tekutině jsou adsorbovány na makromolekuly a mají sníženou difuzní pohyblivost (možná 15 % toho, co by se dalo očekávat od volného roztoku)
- Koncentrace iontů v každé dané buňce se bude poměrně dramaticky lišit (+/- 20 mmol) v závislosti na buňce a na jejím metabolickém zdraví. Zhruba:
- Na+ 10-30 mmol/l
- K+ 130-150 mmol/l
- Mg2+ 10-20 mmol/l
- Ca2+ téměř 0 mmol/l
- Cl- 10-20 mmol/L
- PO4-100-130 mmol/L
- Aniontový náboj bílkovin přispívá k elektroneutralitě
- PH v buňkách se pohybuje od 6.0 až 7,5 a v cytosolu se regionálně mění
- Přestože obsahuje 20-30 % bílkovin, má cytosol viskozitu vody.
Jaké jsou platné recenzované zdroje k tomuto tématu? Bohužel jich je celá řada. Když člověk použije vyhledávač nebo rejstříkovou sekci učebnice, aby vyhledal „intracelulární tekutina“, nevyhnutelně se mu dostane odpovědi, řady hesel nebo stránek či powerpointových slajdů, které – ačkoli jsou všechny svým obsahem vágně podobné – se liší v citovaných hodnotách a nenabízejí nic ve smyslu odkazů. Mnohé z nich nenabízejí vůbec žádné užitečné informace. Obrátíme-li se například k oficiálním vysokoškolským knihám na toto téma (Ganong, str. 2 23. vydání, a Guyton & Hall, str. 4 13. vydání), zjistíme, že o koncentraci cytosolových elektrolytů se hovoří pomocí termínů jako „velké množství“. Ani mimo oficiální bibliografii jinak solidní nabídky, jako je Molekulární biologie buňky, nemají jednoznačné odpovědi. Dokonce se nedokážou shodnout ani na tom, jak tomu říkat (cytosol? Protoplazma? Primordialschlauch?)
Naštěstí stále existují vědci, kteří na toto téma publikují. Pravděpodobně nejlepším článkem je článek Katherine Luby-Phelpsové z roku 1999, který v podstatě obsahuje vše, co byste mohli potřebovat k zodpovězení všech hypotetických budoucích otázek SAQ na toto téma. Dalším vynikajícím příspěvkem zabývajícím se především vlastnostmi vnitrobuněčného materiálu je krátký článek Richarda P. Seara (2005). Pokud je člověk opravdu šílený a má časové možnosti trvale zaměstnaného specialisty (tj. nemá naléhavou povinnost skutečně vykonat nějakou užitečnou práci), může místo toho prozkoumat knihu Gilberta Linga In Search of the Physical Basis of Life (1984), 800stránkovou knihu člověka, jehož publikace o buněčné fyziologii sahají až do 50. let 20. století.
Objem nitrobuněčného prostoru
Jak velká je buňka? To samozřejmě závisí na buňce. Dobrým příkladem odlehlé buňky je oocyt rodu Xenopus, vajíčko africké drápatky, které má průměr 1 mm. Když se mluví o člověku, obvykle se mluví o nitrobuněčné tekutině, jako by to byl relativně homogenní kbelík, ale ve skutečnosti se tento tekutinový prostor skládá z něčeho jako 1014 miniaturních kompartmentů, z nichž každý má trochu jiný objem a složení.
Heterogenita všech těchto objemů je dobře shrnuta v této kapitole databáze BioNumbers, kde lze najít nejrůznější pečlivě odkazované informace. Reprodukujeme ji zde s minimálními úpravami pro případ, že by harvardské servery někdy zkolabovaly.
| Typ buňky | Objem (μm3, nebo femtolitry) | Objem (pikolitry) | Reference |
| Spermální buňka | 30 | 0.03 | Gilmore et al, 1995 |
| Erytrocyt | 100 | 0.1 | Ballas et al, 1987 |
| Lymfocyt | 130 | 0,13 | Schmid-Schonbein et al, 1980 |
| Neutrofil | 300 | 0.3 | Rosengren et al, 1994 |
| Pankreatické β-buňky | 1,000 | 1.0 | Finegood et al, 1995 |
| Enterocyt | 1,400 | 1,4 | Wiśniewski et al, 2012 |
| Fibroblast | 2,000 | 2.0 | Mitsui et al, 1976 |
| Nádor děložního hrdla (HeLa) | 3,000 | 3,0 | Zhao et al, 2008 |
| Vlasové buňky (ucho) | 4,000 | 4.0 | Géléoc et al, 1999 |
| Osteoblast | 4,000 | 4,0 | Beck et al, 2011 |
| Alveolární makrofág | 5,000 | 5.0 | Krombach et al, 1997 |
| Kardiomyocyt | 15,000 | 15,0 | Calvillo et al, 2003 |
| Megakaryocyt | 30,000 | 30.0 | Harker et al, 2000 |
| Adipocyt | 60,000 | 60.0 | Livingston et al, 1984 |
| Oocyt | 4 000 000 | 4000 | Goyanes et al, 1990 |
Je to tedy poměrně široké rozpětí. Navíc je zřejmé, že ne celý obsah buňky bude zabírat „nitrobuněčná tekutina“, bez ohledu na to, jaká je vaše definice tohoto pojmu. Například pro účely této kapitoly bude definice intracelulární tekutiny znít „intracelulární obsah, který není organelou“, čistě proto, že organelám se věnuje jiná kapitola. To, o čem v tomto případě mluvíme, je „šedavá, viskózní, slizká, polotekutá a polotekutá látka“, která zabírá vnitrobuněčný prostor mezi ostatními strukturami (Harvey, 1937).
Záleží na tom, o jaký druh buňky se jedná, tento prostor může představovat velmi malou část celkového objemu. Například u výše uvedeného omentálního adipocytu bude z oněch 60 pikolitrů celkového objemu naprostou většinu zabírat tuk bez vody. To lze dokázat experimentálně: DiGirolamo & Owens (1976) dokázal vypočítat, že objem vody v potkaních adipocytech činí asi 5-7 % celkového objemu, tj. 1,5-2 pikolitry.
Zkrátka, díváme se na velmi malý objem. Proč je to důležité? No. Vnitřní tekutina buňky o objemu 1-2 pikolitry představuje distribuční objem pro rozpustné látky. Molekuly těchto látek tedy musí urazit velmi krátkou vzdálenost, než se vzájemně setkají. Výsledkem je zvýšení rychlosti reakcí, což je užitečné, protože celkové množství molekul činidla pro tak malý objem je nutně malé. Vypůjčíme-li si příklad od Luby-Phelpse (2000), pokud má buňka celkový obsah 1 nanomol proteinu, znamená to, že je v ní přítomno pouze 1000 kopií tohoto proteinu. Naštěstí při tak malém objemu, který je třeba překonat, by vazebná molekula i s nízkou afinitou byla schopna vyčistit a adsorbovat většinu dostupného substrátu.
Obsah bílkovin ve vnitrobuněčné tekutině
Ok, takže objem je malý. Jaké makromolekuly se v něm nacházejí a kolik jich je? Alice B. Fultonová (1982) na to zvážila asi nejpřehlednější odpověď v publikované literatuře. V zásadě se obsah bílkovin v buňkách pohybuje v rozmezí 17 až 35 % hmotnosti, přičemž většina autorů se pohybuje někde kolem 20-30 g/100 ml. Fulton cituje starověké texty (Loewy a kol., 1969) a uvádí následující hodnoty:
- Svalové buňky: 23 % hmotnostních bílkovin
- Erytrocyty:
- Většina ostatních buněk: 17 % až 26 % bílkovin
Měření se obvykle provádí pomocí měření indexu lomu, což je technika, která obvykle nerozlišuje mezi strukturními bílkovinami (např. těmi, z nichž se skládá cytoskelet a organely) a rozpustnými bílkovinami, které tvoří zbytek sliznice.
Takže, jaký je smysl této diskuse? No. Tato koncentrace bílkovin je poměrně vysoká. Je nad obvykle přijímanou koncentrací velkých polymerů, u nichž by se dalo očekávat, že ovlivní difúzi ostatních podobných polymerů, tj. les je příliš hustý. Chang et al (1987) vytvořili matematický model, který předpovídá, že pro polymery o velikosti 50 kDa a více je tato mezní hodnota difúze přibližně 130 g/l, tj. jakákoli vyšší hodnota a ostatní polymery nebudou schopny snadno difundovat roztokem. Jistě, používali polystyren rozpuštěný v benzenu, ale faktem zůstává. Pro srovnání, při úplné krystalizaci bílkoviny vznikne „pevná látka“, která obsahuje pouze 40 % hmotnosti bílkovin
Shrnem lze říci, že bílkoviny ve vnitrobuněčné tekutině jsou na sebe nabaleny tak těsně, že cytosol je třeba označit za „přeplněný roztok“. Zde uvedený kreslený diagram (původně publikovaný Goodsellem v roce 1993 a následně reprodukovaný prakticky každým, kdo kdy psal o cytosolu) názorně ukazuje, jak těsně jsou tato tělíska zabalena. Kresba byla aproximována s využitím známých velikostí a tvarů molekul/elektronového mikroskopu, ale snímky pořízené pomocí SEM (např. Bridgman & Reese, 1984) ukazují, že správně znázorňuje neuspořádanou mikrostrukturu cytosolu. Při pohledu na oocyty Xenopus při zvětšení ~ 80 000 je patrný hustý les vláken a granulí. Zde uvedený obrázek (část jejich obrázku 6) byl ve skutečnosti trochu vyčištěn lýzou buněk a promytím detergentem, aby se odstranila část bílkovinné zátěže, která jinak zakrývala jemnější strukturu. Šipky ukazují na spoje filament Y a T.
Bez přípravy detergentem je vidět veškerý jemný granulární materiál zabalený mezi těmito filamenty. Obrázek nyní připomíná bílý šum (stejní autoři).
Je jasné, že difuze skrz tuto houštinu nebude normální. Menší rozpuštěné látky (např. vaše ionty sodíku a draslíku) musí tyto obrovské překážky obcházet a vydávají se k sobě vyhlídkovou cestou. Z praktického hlediska by to mělo znamenat, že každá reakce, která závisí na rychlosti difuze, bude pomalejší. Pokud molekulám trvá věčnost, než se k sobě dostanou, jistě by se měla snížit čistá rychlost jejich interakce. To však nevidíme.
Jaké chemické vlastnosti pozorujeme u této vysoce nasycené bílkovinné polévky? Allen P. Minton (2006) shrnul léta (především vlastního) výzkumu v tabulce výše odkazovaného článku. Zde je shrnuto:
- Zvýšená vazebná afinita jinak zředěných makromolekul k sobě navzájem
- Zrychlení asociací proteinů např. samoskladba
- Zpomalení difuzně omezených reakcí a proteinových asociací
- Stabilizace proteinů proti tepelné denaturaci
Shrnuto, shlukování nutí proteiny ke skládání a interakci, což vytváří složité konfigurace, které by jinak ve zředěném roztoku nebyly možné. Například Wilf & Minton v roce 1981 zjistil, že zředěné molekuly myoglobinu v roztoku mají o sebe malý zájem, ale přidání 10% roztoku (jakékoli!) jiné bílkoviny způsobí, že se myoglobin spontánně složí do dimerů.
Vlastnosti nitrobuněčné vody
I v krystalizovaném proteinu tvoří pouze 40 % hmotnosti skutečný protein. Zbytek je rozpouštědlo, které zabírá prostory mezi zabalenými molekulami bílkovin (nejsou to přesně obdélníky a nejsou úhledně poskládané). Pokud je rozpouštědlem voda, polovina z ní se nakonec adsorbuje na povrch bílkovin, ale zbytek lze stále považovat za normální kapalnou vodu. V této tenké vrstvě jsou rozpuštěny ionty vnitrobuněčné vody.
Je jasné, že s vázanou adsorbovanou vodou je to trochu jinak. Například vlastnosti rozpouštědla této vody nebudou úplně stejné jako u „volné“ vody. Za prvé bude mít pravděpodobně sníženou chemickou aktivitu. Jak se dalo očekávat, „uspořádaný“ stav vody jí dává několik neobvyklých koligativních vlastností – například Foster et al (1976) zjistili, že její bod mrznutí je snížen. Kromě toho budou v cytosolu existovat kapsy se zvýšenou aktivitou (kolem hydrofilních proteinových struktur) a sníženou aktivitou (kolem hydrofobních).
Kolik vody je v tomto zajatém stavu udržováno proteiny? To je poněkud obtížné říci. Pokusy Linga a dalších (1993) naznačují, že uvnitř buněk je většina vody takto „uspořádána“, ale většina experimentů, které o tomto tématu referují, je poněkud ovlivněna tím, že surové živé buňky, které používají, mají různé homeostatické reakce na experimentální podmínky, které výsledky matou.
Obvykle se lidé snaží tuto odpověď zjistit osmotickou dehydratací buněk. Vyvíjejí osmotický tlak, uvažují, a veškerá „mobilní“ voda by se měla z buňky dostat ven. Pak změříte obsah vody v buňce a vše, co v ní zůstane, musí být „nepohyblivé“, zaparkované na povrchu molekul bílkovin a neschopné migrovat v reakci na osmotický tlak. Cameron et al (1997) uvádí graf (nestydatě ukradený a zobrazený zde vlevo), kde je obsah vody ve zbývajících buňkách vynesen proti ose x zvyšujícího se osmotického tlaku. Když se přímka závislosti tlaku na zbývající vodě extrapolovala z experimentálních důkazů a prodloužila směrem k „nekonečnému“ osmotickému tlaku, skončila protnutím osy y v nějakém nenulovém bodě. V závislosti na tom, jaké buňky jste použili, to skončilo někde mezi 30-90 % celkového obsahu vody.
V podstatě se zdá, že tato voda adsorbovaná na proteiny je základní vodou v buňkách a veškerá „volná“ voda je zbytečný balast. Clegg (1981) při rehydrataci některých vysušených buněk slaných krevet zjistil, že metabolická aktivita se obnovila a byla relativně normální, když bylo buňkám navráceno asi 35 % hmotnosti vody, tj. asi tolik, kolik se očekává k „hydrataci“ všech makromolekul. V těchto krevetách téměř jistě nebyla přítomna žádná volná voda v „objemové fázi“. Jistě, nesnažily se rozmnožovat nebo syntetizovat RNA (to vyžadovalo hydrataci až na 70-80 %), ale jejich syntéza aminokyselin a výměna plynů probíhala relativně normálně. O to pozoruhodnější je skutečnost, že při objektivním měření má tato hustá 20-30% proteinová polévka viskozitu, která se velmi podobá normální vodě (Luby-Phelps, 1994)
Intracelulární tekutina pH
Carter (1972) o tom publikoval velmi vlivný článek, který je často citován v učebnicích fyziologie člověka, přestože autor použil svaly z mloka obrovského (Balanus nubilus), které suspendoval v něčem, čemu se říká „barnacle Ringer’s solution“, což je solanka s obsahem 450 mmol/l sodíku a 518 mmol/l chloridu. Těžko lze číst dál s nějakým respektem k lidské zobecnitelnosti takových údajů, ale pokud bychom tak učinili, zjistili bychom nejdůležitější zjištění: že pH v buňkách je natolik kompartmentalizované, že různé oblasti cytosolu měly divoce odlišné hodnoty pH v rozmezí 6,0 až 7,5. V tomto případě se jedná o pH, které se liší od pH v buňkách.
Koncentrace elektrolytů v intracelulární tekutině
Zpravidla všechny učebnice na otázku týkající se koncentrace elektrolytů v intracelulární tekutině vytvoří Gamblegram, jako je tento (přivlastněno z Linga, 1984, bez svolení jeho pozůstalosti nebo vydavatele).
Tento diagram zde není v Lingově knize uveden, ale lze namítnout, že ani být nemusí, vzhledem k tomu, že Ling vykonal prakticky veškerou průkopnickou práci v oblasti určování chování intracelulárních solutů. Konkrétně v 60. letech 20. století spolu s Ochsenfeldem určil, že tento draslík (a všechny ostatní elektrolyty v cytosolu) není obecně přítomen ve volně dostupné formě, ale je naopak adsorbován na makromolekulární struktury.
Výzkumníci podrobili buňky zkoušce s radioaktivně značenými izotopy a zjistili, že to mělo jen malý vliv na vytěsnění již přítomných elektrolytů, což by se očekávalo, kdyby byly volně distribuovány. Intracelulární elektrolyty jsou z velké části přítomny v komplexech s makromolekulami a jsou mnohem méně pohyblivé, než by se dalo očekávat od modelu buňky, kde veškerý obsah existuje v homogenním vodním vaku. Stejní autoři (Ling & Ochsenfeld, 1973) později potvrdili, že mobilita draslíku z intracelulárního do extracelulárního kompartmentu je přibližně osminová oproti tomu, co by se dalo očekávat z prosté difuze ve volném roztoku. Ze zabitého žabího svalu unikal draslík poněkud ochotněji (rychlost difuze se oproti očekávání snížila pouze o 25 %), protože přestaly fungovat pumpy poháněné ATP a došlo k dezorganizaci struktury bílkovin.
Shodneme se tedy na tom, že tyto ionty nejsou rozpuštěny ve šumícím jezeře volné intracelulární vody, ale jsou spíše vázány v komplexech. To však stále neodpovídá na otázku: kolik čeho tam je? Ukázalo se, že odpověď je poměrně snadná. Ve skutečnosti je to mnohem snazší než všechny ostatní otázky, které jsme v této kapitole zatím položili. Stačí vzít svůj cytosol, vysušit ho mrazem a pak změřit prvkové složení suché hmoty. Mason et al (1981) přesně takto postupovali u některých ledvinových tubulárních buněk před a po ischemickém poškození. Jejich výsledky jsou reprodukovány níže, a to jak ve formě původní tabulky z roku 1981, tak ve formě pěkného lesklého Gamblegramu:
Jak je vidět z divokých výkyvů koncentrace draslíku po i 20 minutách ischemie, složení elektrolytů v buňkách je mnohem tekutější než v extracelulární tekutině (kde by 20mmol změna koncentrace jakéhokoli elektrolytu byla špatně snášena, na úrovni jakéhosi existenčního přežití organismu). Kromě toho má každá buněčná linie mírně odlišnou koncentraci iontů v nitrobuněčném prostředí. Z toho vyplývá nepřesnost hodnot intracelulárních elektrolytů uváděných v učebnicích a jejich obecná neochota uvádět jakákoli čísla. Prakticky každé číslo, které uvedete, bude chybné. Například Masonovy distální tubuly měly v cytosolu 11 mmol/l sodíku, ale Poole-Wilson (1975) zjistil v myocytech levé komory přibližně 44 mmol/l a v levém čtyřhlavém svalu 20 mmol/l sodíku. Alam et al (1977) uvádí hodnoty přibližně 25 mmol/l pro sodík a 145 mmol/l pro draslík v některých selhávajících jaterních buňkách. Stručně řečeno, kvůli neuspořádanému a nepředvídatelnému prostředí jakékoli buňky je obtížné uvádět konkrétní čísla.
.