ÚVOD
Ibuprofen patří do skupiny nesteroidních protizánětlivých léčiv (NSAID) používaných k léčbě různých zánětlivých procesů, bolesti nebo horečky. Mechanismus, který je základem účinků ibuprofenu, vychází z inhibice aktivity cyklooxygenázy (COX), která je nezbytná pro syntézu prostaglandinů (PG).1 PG jsou produkovány z kyseliny arachidonové pocházející z plazmatické membrány a lokální produkce PG má účinky podobné hormonům. V lidských tkáních jsou exprimovány dvě izoformy COX: konstitutivně exprimovaná izoforma COX-1 existuje ve většině tkání, zatímco izoforma COX-2 je silně indukována během zánětlivé odpovědi, včetně patologických stavů chronického zánětu a rakoviny tlustého střeva.2 Z různých produktů odvozených od COX-2 se nejvyšší hladiny PGE2 nacházejí v nádorech a ovlivňují různé procesy, včetně buněčné proliferace a apoptózy.3 V normální fyziologii hraje PGE2 roli při udržování regulačních procesů gastrointestinální sliznice, jako je sekrece hlenu a dilatace cév.4 Dlouhodobá léčba NSAID tak může vést k nežádoucím účinkům, včetně střevního krvácení. Většina NSAID, včetně ibuprofenu, inhibuje obě izoformy COX.
Bylo doloženo, že profylaktické užívání NSAID snižuje riziko úmrtí na kolorektální karcinom.5-9 Například při užívání 300 mg denní dávky aspirinu po dobu 10 let byl zjištěn statisticky významný protektivní účinek.7,10,11 Podobné snížení rizika bylo zaznamenáno při užívání 200 mg denní dávky ibuprofenu8,11-19 u různých typů nádorů: V případě rakoviny tlustého střeva se riziko snížilo o 51 %, u rakoviny prsu o 72 %, u rakoviny prostaty o 62 % a u rakoviny plic o 59 %.19
JAK IBUPROFEN PŘEDCHÁZÍ RAKOVINĚ?
Shromažďující se důkazy odhalily, že zánět podporuje nádorové bujení,20,21 zejména pokud je tkáň v chronickém zánětu. V nádorovém mikroprostředí si zánětlivé buňky vyměňují signály s nádorovými buňkami. Stromální buňky vylučují faktory přežití pro nádorové buňky, zatímco nádorové buňky produkují cytokiny, které spouštějí proteolytickou remodelaci extracelulární matrix stromálními buňkami nebo tvorbu nových cév.20,22 Ibuprofen inhibuje aktivitu COX a následnou tvorbu prozánětlivých PG; předpokládá se, že toto působení je základem chemopreventivního účinku ibuprofenu. PGE2 například aktivuje receptory spřažené s G proteinem PGE2, které stimulují různé signální dráhy zapojené do buněčné proliferace a přežívání.23,24
V tomto článku autoři podávají přehled dalších mechanismů účinku, které jsou nezávislé na inhibici COX-2, s cílem zvýšit povědomí o tom, že klinické účinky ibuprofenu mohou být zprostředkovány několika buněčnými procesy. Předkládané důkazy byly získány z vyhledávače PubMed s použitím hesla „ibuprofen AND cancer“. Pro přehled byly vybrány studie uvádějící účinky nezávislé na COX, včetně těch, které byly provedeny v laboratoři autorů.
DALŠÍ MECHANISMY, KTERÝMI IBUPROFEN ZASÁHNE NÁDOROVÉ BUŇKY
V roce 2015 Matos a Jordan25 přezkoumali léčbu nádorových buněk ibuprofenem. Kolorektální buňky HCT-116 neexprimují COX-2, ale léčba ibuprofenem o koncentraci 2 mMol/l vyvolala proapoptotické účinky.26 Ibuprofen v nízké koncentraci 100 µMol byl dále identifikován jako přímý a na COX nezávislý ligand peroxizomového proliferátorem aktivovaného receptoru gama (PPARγ)27 a bylo prokázáno, že stimuluje jeho jadernou aktivitu na modelech vzniku rakoviny tlustého střeva u potkanů.28 Proapoptotický účinek pozorovaný u ibuprofenu tedy může být částečně důsledkem aktivace PPARγ, která vede ke snížení regulace antiapoptotického transkripčního faktoru NFκB.28
Další COX-nezávislá buněčná odpověď po léčbě ibuprofenem byla zaznamenána za účasti P75NTR, člena nadrodiny receptorů TNF. Léčba nádorových buněk ibuprofenem o koncentraci 1 mMol/l vedla ke stabilizaci stability mRNA p75NTR v závislosti na dráze p38 mitogenem aktivované proteinkinázy, což vedlo ke zvýšení hladiny exprese29 a indukci apoptózy a potlačení růstu.30
Podobný účinek podporující apoptózu byl zaznamenán u buněk HCT116, kdy bylo zjištěno, že léčba ibuprofenem (1,5 mM po dobu 24 hodin) senzibilizuje tyto buňky vůči ligandu vyvolávajícímu apoptózu související s TNF.31 Základní mechanismus zahrnoval expresi membránového receptoru pro ligand indukující apoptózu související s TNF: receptor smrti 5, dalšího člena nadrodiny receptorů TNF.
Dále bylo zjištěno, že léčba ibuprofenem (1 mMol/l po dobu 24 hodin) významně snižuje jaderné hladiny β-kateninu v buňkách kolorektálního nádoru SW480 a DLD-1. Důsledně byla potlačena exprese jednoho z jeho transkripčních cílů, proproliferačního genu cyklinu D1.32 Ačkoli základní mechanismus ještě nebyl stanoven, zdá se, že tento účinek ibuprofenu má zvláštní význam pro prevenci kolorektálního karcinomu, protože nadměrná signalizace β-kateninu může způsobit nevhodnou stimulaci růstu kmenových buněk sliznice tlustého střeva.33
Současně s účinkem na signalizaci β-kateninu zasahoval ibuprofen také přímo do dráhy NFκB. Rychlým účinkem léčby ibuprofenem pozorovaným v buňkách je inhibiční fosforylace GSK-3β na serinu 9.32 Bylo zjištěno, že tato modifikace negativně reguluje signalizaci NFκB, a to v kroku následujícím po degradaci jejího inhibičního proteinu IkBα, a potlačuje expresi anti-apoptotických cílových genů NFκB, jako jsou BCL2 a BIRC5.
Dalšími příklady účinků 100 µMol ibuprofenu nezávislých na COX jsou inhibice exprese integrinu u neutrofilů34 nebo uvolňování prozánětlivých cytokinů zprostředkované kaspázou u buněk HCT-116 a HeLa35.
IBUPROFEN, ALTERNATIE SPLICINGU A RAKOVINA
Nádorové buňky se liší svým programem genové exprese od odpovídajících diferencovaných normálních buněk. Kromě transkripční regulace na genových promotorech posledních 15 let jasně ukázalo, že jako významný mechanismus regulace genové exprese slouží alternativní sestřih. Alternativní sestřih například vytváří varianty transkriptu, které mohou být buď nefunkční a rychle degradovány, nebo mohou být přeloženy do proteinových izoforem s různými, někdy antagonistickými funkčními vlastnostmi v důsledku rozdílného využití funkčních proteinových domén.36,37
Nedávno byla jako další COX-nezávislý účinek ibuprofenu identifikována inhibice alternativní sestřihové varianty RAC1b.38 Jako jeden ze spouštěčů zvýšené exprese nádorového proteinu RAC1b, sestřihové varianty malé GTPázy RAC1, byl prokázán zánět tlustého střeva. Protein RAC1b obsahuje další doménu kódovanou alternativním exonem o délce 57 párů bází (exon 3b), který propůjčuje proteinu zvýšenou aktivaci a vytváří hyperaktivní variantu schopnou stimulovat signalizaci NFκB.39-42 Když byly kolorektální buňky ošetřeny ibuprofenem, ale nikoli aspirinem nebo flurbiprofenem, došlo k výraznému snížení hladiny mRNA i proteinu RAC1b in vitro i in vivo.38 Zatímco mnoho studií o vlivu NSAID na životaschopnost nádorových buněk používalo koncentrace až 2 mMol/l,43 účinek ibuprofenu na alternativní sestřih RAC1b byl pozorován při nízkých dávkách 100 µMol. Zajímavé je, že ibuprofen inhiboval RAC1b-pozitivní kolorektální buňky HT29 více než normální kolonocyty a také ovlivnil jejich růst v podobě podkožních nádorových xenografů u myší. Inhibiční účinek ibuprofenu bylo možné zachránit, když byla v buňce HT29 exprimována cDNA sekvence RAC1b nezávislá na sestřihu38. To naznačuje, že ibuprofen působí přímo na alternativní sestřih.
Další zpráva o modulaci alternativního sestřihu byla získána při kombinované léčbě buněk karcinomu prostaty ibuprofenem a epigalokatechin-3-gallátem (EGCG), složkou zeleného čaje s antikarcinogenními vlastnostmi, která podporuje zástavu buněčného cyklu G0/G1 a apoptózu. V tomto případě byla rovnováha mezi anti a proapoptotickými sestřihovými variantami BCL-X a MCL-1 posunuta směrem ke kratším a proapoptotickým variantám BCL-X(S) nebo MCL-1(S).44 Ačkoli mechanismus nebyl zcela identifikován, zahrnuje aktivaci proteinové fosfatázy PP1, o níž je známo, že defosforyluje regulační proteiny zapojené do sestřihu pre-mRNA.
MECHANISMUS MODULACE SPLICOVÁNÍ POMOCÍ IBUPROFENU
Při expresi protein kódujících genů v lidských buňkách vytváří RNA polymeráza 2 primární transkript, pre-mRNA, která obsahuje kódující exony oddělené intronickými sekvencemi. Během transkripce jsou konzervované nukleotidové sekvence kolem každého exon-intronového spoje rozpoznány spliceosomem, makromolekulárním strojem zahrnujícím pět malých jaderných ribonukleoproteinových částic (U1, U2, U4, U5 a U6 malý jaderný ribonukleoprotein),45,46 který pak během procesu sestřihu mRNA odstraňuje introny. Funkci spliceosomu napomáhají splice enhancerové nebo silencerové elementy, krátké sekvence nacházející se v exonech nebo intronech, které buď podporují, nebo inhibují produktivní rozpoznání daného exonu spliceosomem. Splicingové faktory rozpoznávají tyto splice enhancer nebo silencer elementy, které většinou patří do rodiny proteinů bohatých na serin a arginin nebo heterogenních jaderných ribonukleoproteinů. Často působí antagonisticky, takže modulace vazby zajišťuje mechanismus, který umožňuje zařazení nebo vynechání alternativního exonu, a tím vznik variantních transkriptů. Celkově soubor sestřihových faktorů exprimovaných v dané buňce a jejich relativní hladiny exprese v buněčném jádře působí v kombinatorickém režimu při regulaci alternativního sestřihu.
V případě RAC1b je alternativní sestřih regulován enhancerovým elementem v exonu 3b, který je rozpoznáván sestřihovým faktorem SRSF1, a sousedním silencerovým elementem rozpoznávaným SRSF3.47
V lidských kolorektálních buňkách je dostupnost SRSF1 v jádře hlavním faktorem regulujícím zařazení nebo vynechání exonu 3b.48
Jedním z mechanismů, kterým ibuprofen skutečně ovlivňuje alternativní sestřih v buňkách, je fosforylační stav SRSF1. Experimenty s buněčnou frakcionací a imunoblotem odhalily, že léčba ibuprofenem způsobila snížení fosforylace SRSF1 (nepublikované údaje). Naproti tomu léčba aspirinem neměla na SRSF1 žádný takový účinek. To ukázalo, že inhibiční účinek ibuprofenu na sestřih RAC1b zahrnuje posttranslační regulaci subcelulární lokalizace SRSF1.48
Hlavní proteinkinázou odpovědnou za fosforylaci SRSF1 je SRPK1, která se nachází jak v cytoplazmě, tak v buněčném jádře.49,50 Tento proces je částečně řízen signalizací receptorů růstových faktorů.51 Jak je znázorněno a popsáno na obrázku 1, autoři pozorovali, že léčba ibuprofenem vyvolala translokaci SRPK1 z jádra do cytoplazmy, což korelovalo se snížením hladiny fosforylace SRSF1 a proteinu RAC1b, jak bylo zjištěno v celobuněčných lyzátech pomocí Western blotu. Takový účinek nebyl pozorován, když byly buňky za stejných podmínek ošetřeny aspirinem, což podtrhuje COX-nezávislé působení ibuprofenu a specifičnost jeho účinku na modulaci faktorů sestřihu.
.