Normální leukocyty

Pět hlavních kategorií leukocytů u savců jsou neutrofily, eozinofily, bazofily, lymfocyty a monocyty. První tři se souhrnně nazývají granulocyty, protože obsahují granula ve své cytoplazmě, a poslední dvě se souhrnně nazývají mononukleární buňky s odkazem na jejich kulatá jádra. Tyto souhrnné termíny jsou poněkud zavádějící, protože některé granulocyty mají sotva znatelné granule a většina monocytů nemá kulatá jádra. Granulocyty většiny savců jsou klasifikovány jako neutrofily, eozinofily a bazofily na základě reakce jejich specifických granulí s barvivy v polychromních krevních barvivech, tzv. barvení podle Romanowského.

Prototypem pro klasifikaci granulocytů jsou lidé, u nichž jsou granule neutrofilů malé a růžové se slabou afinitou k azurovým komplexům, granule bazofilů jsou tmavě fialové kvůli silné afinitě k azurovým komplexům a eozinofily jsou intenzivně oranžové kvůli silné vazbě eozinu. Klasifikace granulocytů u živočišných druhů je částečně založena na homologii vzhledu s lidskými granulocyty a částečně na prokázání homologie obsahu a funkce enzymů.

Existuje mnoho rozdílů, některé jemné a některé zjevné, mezi druhy i v rámci druhů.

Zralé neutrofily

Synonyma: Polymorfonukleární buňky (PMN), segmentované neutrofily

Segmentovaný neutrofil nebo heterofil u ptáků, plazů a některých savců je převládajícím granulocytem. U mnoha druhů je převládajícím leukocytem ve zdraví. Ve zdraví se obvykle z kostní dřeně uvolňují pouze zralé neutrofily, které cirkulují v krvi. Protože zralé neutrofily v prototypu lidské krve mají jádra segmentovaná do laloků kondenzovaného chromatinu spojených vlákny, nazývají se zralé neutrofily segmentované neutrofily („segs“ nebo „neuts“). Zralé neutrofily mnoha živočišných druhů nemají zřetelné uspořádání lalůčků a vláken (mají zúžená jádra nebo nepravidelné/hrbolaté jaderné obrysy), přesto se jim také říká segmentované neutrofily. Neutrofily jsou součástí vrozeného imunitního systému a představují první linii (a jsou nezbytné) obrany proti bakteriálním patogenům. Neutrofily mají krátký poločas rozpadu – po uvolnění do periferní krve přetrvávají pouze 10-15 hodin (Carakostas et al. 1981). Při analýze krve odebíráme vzorky pouze z cirkulující populace neutrofilů, nikoli z marginální nebo rezervní populace v kostní dřeni. U většiny druhů, kromě koček, je poměr cirkulujícího a marginálního fondu 1:1 (Carakostas et al. 1981) (u koní se odhaduje na 3:1). K uvolňování neutrofilů z marginálního rezervoáru dochází v reakci na kortikosteroidy (endogenní nebo exogenní), které snižují adhezní molekuly zodpovědné za marginalizaci (nebo hlídkování endotelu prostřednictvím selektinem zprostředkovaného rolování) a mají potenciál zdvojnásobit počet zralých neutrofilů (tzv. „stresový leukogram“).

Nezralé neutrofily

U některých zvířat lze v periferní krvi pozorovat nezralé neutrofily a jejich přítomnost se nazývá levý posun. Přítomnost zvýšeného počtu nezralých neutrofilů (tj. nad stanovený referenční interval pro daný druh) obvykle znamená reakci na zánětlivé cytokiny a zánětlivý leukogram. Nejběžnějším typem nezralých neutrofilů pozorovaným v krvi je pásový neutrofil, který je o jedno stadium méně zralý než segmentovaný neutrofil. Páskové neutrofily se od zralých neutrofilů odlišují tvarem jádra, které postrádá jasnou segmentaci (segment je definován jako >50% zúžení šířky jádra) a nepravidelný obrys zralého neutrofilu. Za určitých situací se uvolňují stadia starší než pásy (např. metamyelocyty; viz níže). Posun doleva je obvykle (ale ne vždy) doprovázen toxickou změnou (toxická změna nemusí být patrná, pokud se jedná o mírný posun doleva nebo pokud dochází pouze k uvolnění nezralých buněk z dřeně bez urychleného zrání). Nezralé neutrofily však mohou být předčasně uvolněny také při poruchách kostní dřeně, jako je leukémie nebo těžké poškození kostní dřeně (ani v tomto případě nejsou nezralé neutrofily obvykle toxické).

Zralé neutrofily jsou klasifikovány na základě stupně jejich zrání. Nejdříve identifikovatelným specifickým prekurzorem neutrofilů je myelocyt, který se diferencuje v metamyelocyt, poté v pásový neutrofil a nakonec ve zralý segmentovaný neutrofil. Pouze myelocyt je schopen dělení – všechna zralejší stadia (metamyelocyt, pásový neutrofil, segmentovaný neutrofil) nejsou schopna dělení (postmitotická). Hlavním kritériem pro odlišení nezralých neutrofilů od sebe navzájem je tvar jejich jádra, které se s dozráváním buňky začíná odsazovat nebo zužovat. Myelocyt má kulaté jádro, metamyelocyt má odsazené nebo ledvinovité jádro a band má jádro ve tvaru podkovy nebo rovnoběžníku (sestavený obrázek nezralých neutrofilů naleznete na stránkách levý posun nebo toxická změna). Je důležité rozlišovat mezi nezralými neutrofily a monocyty, zejména u psa, kde se tyto buňky mohou navzájem podobat (viz monocyt níže). Toho se dosáhne společným pohledem na všechny znaky buňky (jaderný chromatin, tvar jádra, umístění jádra v buňce, barva cytoplazmy, cytoplazmatické hranice, přítomnost či nepřítomnost vakuol a granulí) (viz obrázek vpravo).

Při provádění diferenciálního počtu buněk zařazujeme neutrofily do kategorie „segmentované“, pokud má jádro oblasti, které jsou výrazně zúžené (více než 50 % šířky jádra) nebo má boční výběžky, jejichž výsledkem jsou nepravidelné jaderné okraje. Buňka, jejíž jaderné okraje jsou hladké a rovnoběžné (nebo téměř rovnoběžné), je „páskový“ neutrofil a měla by se tak počítat. Nezralejší stadia se klasifikují podle tvaru jader, jak je popsáno výše. Všimněte si, že buňky mezi těmito přesně definovanými stádii se v krvi vyskytují vždy. Za těchto okolností bude daná buňka zařazena do zralejší kategorie, tj. buňka s jadernými znaky na půli cesty mezi pásovým a segmentovaným neutrofilem bude nazvána segmentovaným neutrofilem. Nezralejší neutrofily mohou být počítány samostatně jako jejich specifické kategorie nebo seskupeny jako „pásové“ neutrofily. Na Cornellově univerzitě jsou všechny nezralé neutrofily (pásové neutrofily, metamyelocyty a myelocyty) v našem diferenciálním počtu buněk seskupeny do kategorie „pás“. Na příkladu výše uvedeného obrázku by se buňky B až D počítaly jako „bandy“ a pouze buňka A by se počítala jako „segmentovaný“ neutrofil. Pokud však pozorujeme stadia, která jsou méně zralá než pásový neutrofil (metamyelocyt nebo myelocyt), uvedeme tuto informaci ve výsledcích (např. posun doleva se rozšiřuje na myelocyty). Přítomnost těchto nezralejších stadií obvykle ukazuje na závažnější zánět než přítomnost samotných pásových neutrofilů.

Eozinofily

Eozinofilní granule jsou u většiny zvířat oranžové, ale vždy existují výjimky, zejména u exotů. Granule v eozinofilech leguánů a některých ptáků jsou ve skutečnosti světle modré. Obecně jsou jádra zralých eozinofilů kratší a méně segmentovaná než jádra neutrofilů a cytoplazma, pokud je viditelná, je bledě modrá. Existují výrazné druhové rozdíly, pokud jde o počet, velikost a tvar eozinofilních granulí.

Největší vnitrodruhové rozdíly jsou u psích eozinofilů. Výrazná variabilita ve velikosti, počtu a tvaru granulí se vyskytuje uvnitř i mezi jedinci jakéhokoli plemene. Specifická a předvídatelná morfologická varianta eozinofilů se vyskytuje u chrtů, jiných chrtů (např. vipetů, deerhoundů) a u některých zlatých retrívrů. Eozinofily u těchto plemen postrádají viditelná granula a vypadají jako buňky s mírně segmentovanými jádry, šedou cytoplazmou a vakuolami. Někdy jsou mylně považovány za toxické neutrofily nebo monocyty a nazývají se „vakuolizované“ nebo „šedé“ eozinofily (viz reprezentativní snímky těchto eozinofilů v galerii psí krve v albu hematologie). Na hematologickém analyzátoru ADVIA se přesouvají do brány monocytů (obsahují méně peroxidázy než neutrofily nebo normální granulované eozinofily).

Bazofily

Prototypické bazofily lidské krve jsou vyplněny malými, kulatými, tmavě fialovými granulemi. Podobné bazofily se nacházejí u koní, velbloudů a přežvýkavců. Tyto buňky obsahují mnoho malých tmavě fialových granulí, které u mnoha buněk zakrývají jádro. Některé bazofily mají málo granulí, což je pravděpodobně důsledek degranulace ve vzorku. Nízký počet bazofilů se běžně vyskytuje v krvi zdravého skotu a koní, méně však u velbloudů.

Psí bazofily je obtížné rozpoznat, protože mnohé z nich nemají snadno patrné granule. Je to proto, že granule jsou světle levandulové versus fialové. Hlavními identifikačními znaky psích bazofilů jsou dlouhé a složené jádro, popisované jako „stužkovité“, a neobvyklý šedý až levandulový odstín cytoplazmy. Některé bazofily obsahují několik zjevných světle fialových granulí (granule jsou lépe viditelné u buněk, které jsou prasklé). Bazofily jsou v krvi zdravých psů vzácné. Kočičí bazofily jsou plné malých, mírně oválných granulí, které jsou spíše světle levandulové než tmavě fialové. Jádro se u mnoha z nich jeví jako vakuoly, což jsou ve skutečnosti granule ležící na chromatinu. Bazofily jsou v krvi zdravých koček vzácné.

Lymfocyty

Většina lymfocytů, které cirkulují u zdravých psů, koček, velbloudů a koní jsou malé (zralé) buňky, které mají kulatá jádra s hladkým, hustým chromatinem a malým lemem světle modré cytoplazmy. Chromatin je tak hustý, protože se většinou jedná o heterochromatin (buňka aktivně nepřepisuje DNA). Lymfocyty je třeba odlišit od jádrových červených krvinek (viz níže). Některé lymfocyty všech druhů mohou mít zvýšené množství velmi světle modré až bezbarvé cytoplazmy. Ty se nenazývají reaktivní, ale považují se pouze za normální „varianty“. Některé lymfocyty jsou o něco větší a mají jemnější a volnější chromatinovou kresbu. Lymfocyty vyskytující se v krvi normálních přežvýkavců jsou vzhledově značně variabilní. Mnohé z nich jsou intermediární lymfocyty s volně shlukovaným chromatinem a poměrně hojnou cytoplazmou. Ne všechny lymfocyty v krevních nátěrech jsou kulaté. Některé jsou deformovány do jiných tvarů mechanickými silami, které na ně působí při roztírání, a některé jsou tvarovány kontaktem s červenými krvinkami. Velikost lymfocytů obvykle určujeme podle velikosti jejich jader ve vztahu k neutrofilům (které jsou u všech druhů stejně velké), jak ukazuje následující tabulka. Také je třeba odlišit normální lymfocyty od jaderných červených krvinek, reaktivních lymfocytů a neoplastických buněk (které mohou být myeloidní nebo lymfoidní). Více informací o této problematice je uvedeno níže.

Velikost lymfocytů

Velikost lymfocytu	Velikost jádra ve vztahu k neutrofilu
Malý	Jádro lymfocytu se vejde. uvnitř neutrofilu
Střední	Jádro lymfocytu je stejně velké jako jádro neutrofilu
Velké	Vnitř jádra se vejde neutrofil.

Další lymfocyty, které se mohou vyskytovat v krvi, jsou:

• „Reaktivní“ lymfocyty jsou spojeny s imunitní reakcí. Mohou mít různou velikost (od malých po velké), ale mají shlukovaný (heterochromatin) chromatin a obvykle zvýšené množství hlubší modré cytoplazmy, která je poměrně hladká. Některé mohou mít zřetelné cytoplazmatické vakuoly. Je důležité odlišit reaktivní velké lymfocyty od „blastů“ spojených s leukémií (viz níže). K jejich rozlišení používáme různé techniky včetně cytologických znaků, klinického nálezu a ostatních výsledků hemogramu. Reaktivní lymfocyty se mohou vyskytovat u jakéhokoli zvířete, ale jsou poměrně časté v krvi mladých zvířat, zejména těch, která byla nedávno očkována.
• Granulární lymfocyty: Tyto lymfocyty se vyskytují v malém množství i u zdravých zvířat (tvoří 1-10 % všech lymfocytů). Granulární lymfocyty se vyznačují přítomností malých červených granulí shromážděných do jedné oblasti cytoplazmy, obvykle uvnitř důlku jádra. Granulární lymfocyty jsou buď cytotoxické T-lymfocyty, nebo přirozené zabíječské buňky. Zvýšený počet granulárních lymfocytů lze pozorovat u reaktivních stavů (např. infekce Ehrlichia canis u psů, chronické onemocnění ledvin u psů) nebo jako součást primární leukémie (leukémie granulárních lymfocytů).

Lymfocyty vs jádrové červené krvinky

Velmi pozdní stadium nRBC, jako je metarubricyt, se od lymfocytů odlišuje polychromatofilní cytoplazmou a pyknotickými jádry. Dřívější stadia, jako např. bazofilní rubricyt, mají sice větší problém, ale ve srovnání s lymfocyty mají sytěji modrou cytoplazmu a hruběji kondenzovaný chromatinový vzor.

V úvahu lze vzít i celkový kontext nátěru; např. u nRBC by se očekávala výrazná polychromázie (regenerační reakce). To neplatí u velbloudů a koček, kde se nRBC často vyskytují v krvi v různých situacích, nejen při regenerativních anémiích.

Reaktivní lymfocyty versus blasty

Je důležité rozlišit velké reaktivní a neoplastické krvetvorné buňky („blasty“). Ty se nevyskytují u normálních zvířat, ale pouze u zvířat s neoplazií krvetvorby (akutní leukémie, lymfom s leukemickou fází nebo vzácně u myelodysplastického syndromu). Všimněte si, že odlišení reaktivních lymfocytů od leukemických „blastů“ může být velmi obtížné u zvířat s nízkým počtem problematických buněk, tzv. velkých modrých buněk. Přítomnost neoplastických buněk ukazuje na leukémii, zatímco reaktivní lymfocyty ukazují na antigenní stimulaci (velmi rozdílný význam). Důvod, proč buňkám říkáme „blasty“, je ten, že podle jejich morfologických znaků nemůžeme jednoznačně určit jejich linii; je zapotřebí dalších nástrojů, jako je imunofenotypizace a cytochemické barvení. Podrobnější informace o tom, jak rozlišujeme tyto dva velmi odlišné typy leukocytů v krvi (reaktivní nebo neoplastické), naleznete na stránce „velké modré“ buňky.

Monocyty

Monocyty jsou leukocyty, jejichž identifikace je nejproblematičtější, protože mohou být poměrně variabilní co do velikosti a vzhledu. Často jsou větší než neutrofily a obvykle jsou největším leukocytem, ale neexistují žádné konzistentní druhové rozdíly. Jádro může být kulaté, ledvinovité až pseudolobulární (může napodobovat neutrofil). Občas může mít i tvar pásku, zejména u psů, a může být zaměněno s páskovými neutrofily. Chromatin monocytů je však méně hustý než u neutrofilů a je popisován jako krajkový až mírně shlukovitý. Cytoplazma je obvykle hladká a modrošedá a může obsahovat několik různě velkých vakuol a příležitostně několik velmi jemných růžovočervených granulí. Některé z nich, jako např. koňský monocyt, se podobají lymfocytům. Struktura cytoplazmy monocytu je mírně zrnitá nebo hrubá ve srovnání s cytoplazmou lymfocytů, která je velmi hladká a sklovitá.

Související odkazy

• Interpretace změn počtu jednotlivých leukocytů a přítomnosti abnormálních leukocytů v krvi, např. žírných buněk, histiocytů.
• Vzorky leukocytů: Fyziologická leukocytóza, stresový leukogram, zánětlivý leukogram, leukémie
• Morfologické znaky nRBC a interpretace zvýšeného počtu v krvi.
• Morfologické znaky nezralých neutrofilů
• Morfologické znaky toxických změn neutrofilů.
• Rychlý průvodce testem: Rychlý průvodce interpretací změn ve výsledcích hematologických testů
• Atlas: Pro sestavování obrazů.