ABOVE: upraveno z © ISTOCK.com, tera vector
Téměř vždy je těžší něco postavit než zbořit. Stejně tak srážení genů představuje větší výzvu než jejich vybíjení. Je to realita, kterou budou muset vědci překonat, aby z editace genů vytěžili co nejvíce. Vyřazování genů umožňuje vědcům studovat účinky specifických variant genů, používat reportérové geny, jako je zelený fluorescenční protein, ke sledování genových produktů v čase a prostoru, zkoumat regulaci genomu a nakonec opravovat geny způsobující onemocnění. „Je to opravdu efektivní způsob, jak prozkoumat každou bázi genu,“ říká Greg Findlay, doktorand na Washingtonské univerzitě.
CRISPR-Cas9, technologie editace genů známá svou uživatelskou přívětivostí, dokáže geny vyřadit nebo vyřadit. Vyřazení genu spočívá ve vložení CRISPR-Cas9 do buňky pomocí vodicí RNA, která nástroj nasměruje na gen, o nějž má zájem. Cas9 gen přestřihne, čímž přeruší obě vlákna DNA, a běžný mechanismus opravy DNA v buňce řez opraví pomocí procesu zvaného nehomologní spojování konců (NHEJ). NHEJ je vysoce účinný, ale nepřesný. Tento proces má tendenci vnášet chyby v podobě malých inzercí nebo delecí, které obvykle stačí k vyřazení genu.
Chcete-li však gen vyřadit, musí být řezy opraveny velmi přesně, bez dodatečných inzercí nebo delecí. To vyžaduje využití druhého mechanismu opravy DNA zvaného homologicky řízená oprava (HDR), který – alespoň v savčích buňkách – probíhá méně efektivně, takže jeho frekvence je oproti NHEJ zakrnělá. Celý proces dále komplikuje skutečnost, že některé genové lokusy a typy buněk jsou ze své podstaty pro editaci pomocí CRISPR-Cas9 méně příznivé.
V posledních několika letech vědci vyvinuli mnoho nových strategií, jak zvýšit účinnost knokautu velkých i malých genů pomocí CRISPR-Cas9, a cestou navrhli a otestovali nové aplikace tohoto typu editace genů. V tomto článku The Scientist zkoumá několik nejslibnějších přístupů.
Vyberte to
Výzkumník: Jon Chesnut, senior director of synthetic biology R&D, Thermo Fisher Scientific
Projekt: Při vývoji soupravy pro značení genů nazvané Truetag, kterou společnost Thermo Fisher uvede na trh koncem tohoto roku, použil Chesnut selektivní markery ke zvýšení
účinnosti. Selektivní marker – v tomto případě gen rezistence vůči antibiotikům – je přilepen na fluorescenční proteinovou značku a vpraven do
mimozemských buněk. Tyto buňky se pak pěstují v kultuře s příslušným antibiotikem. Gen rezistence poskytuje selektivní výhodu buňkám, které jej nesou; pouze ony jsou schopny růstu, a proto ty, které rostou, obsahují značku zájmového genu. I když je účinnost vložení genu nízká, mohou výzkumníci použít selekci antibiotikem po dobu jednoho týdne nebo déle, aby nakonec získali vysoké procento buněk s úspěšným vložením.
Při použití antibiotika puromycinu nebo blasticidinu se soupravou se Chesnutovu týmu podařilo zvýšit míru vložení genu z 10-30 % na 90 % nebo více u některých buněčných populací. U několika obzvláště obtížných genů se míra vložení zvýšila z méně než 1 procenta na více než 90 procent. Podle Chesnuta je důležité otestovat více dávek antibiotik na buněčné linii, kterou plánujete použít, abyste našli správnou dávku: chcete zabít buňky bez inzerce, ale ne buňky s úspěšnou inzertací.
Zkuste to: Selektivní markery fungují nejlépe, když je gen, který vás zajímá, vysoce exprimován, říká Chesnut. „Pokud tomu tak není, můžete stále dosáhnout selekce, ale nemusíte dosáhnout dostatečné exprese vaší fluorescenční proteinové značky, abyste ji mohli detekovat.“ Platí také obecná omezení CRISPR-Cas9. „Existují oblasti genomu, které se pomocí CRISPR špatně řežou, a my si stále nejsme jisti proč,“ dodává. A některé typy buněk nepřijímají snadno cizí DNA, RNA nebo komplexy RNA-protein – tři způsoby doručení CRISPR-Cas9.
Pro větší štěstí při vkládání selektovatelných markerů se ujistěte, že v okruhu 10 párů bází od požadovaného místa pro vložení genu se nachází takzvaná sekvence PAM, krátká značka v cílové DNA, kterou musí CRISPR-Cas9 rozpoznat, než provede řez, říká Chesnut. Ve větší vzdálenosti od místa řezu může být účinnost vložení příliš nízká na to, aby byla funkční. Bez místa PAM můžete zkusit TALEN nebo nukleázy se zinkovými prsty, i když tyto starší techniky editace genů jsou složitější než CRISPR.
Timed Inhibition
Výzkumník: Jacob Corn, genomový biolog, Švýcarský federální technologický institut, Curych
Projekt: Vědci nechápou, proč dráha NHEJ v savčích buňkách výrazně převyšuje dráhu HDR. „Kvasinky dělají HDR jako blázen,“ říká Corn. Ve snaze oživit tento proces opravy DNA v lidských buňkách a zlepšit kontrolu genových knock-inů se on a jeho tým snaží zjistit, jak je HDR regulována. Prověřovali lidské buňky a hledali geny, jejichž vyřazení vede ke zvýšení HDR v buňce, a poté hledali malé molekulové inhibitory těchto genů. Jeden z genů, který se objevil, kóduje CDC7, kinázu, která reguluje přechod buněčného cyklu do fáze S; její inhibitor XL413 zvýšil účinnost vyřazení genu dvakrát až třikrát (BioRXiv, DOI: 10.1101/500462, 2018). Je to proto, že HDR se vyskytuje pouze v některých částech buněčného cyklu, včetně fáze S, říká Corn. Pokud přidáte inhibitor XL413 současně s použitím CRISPR-Cas9 k editaci cílového genu, buňky se nahromadí ve fázi bezprostředně před S fází. Když pak XL413 odstraníte, všechny buňky přejdou do fáze S a zvýší se účinnost knock-inu.
Corn použil tuto techniku u mnoha imortalizovaných lidských buněčných linií a u lidských T buněk. Dokáže vyřadit krátké úseky DNA, jako jsou SNP, i velké geny. Neexistuje žádný důvod, proč by to nemělo fungovat u myší, říká, i když to ještě netestoval.
Zkuste to: „Načasování je naprosto klíčové,“ říká Corn. Cas9 musí řezat DNA ve stejnou dobu, kdy je přidán XL413. Pokud při editaci pomocí CRISPR-Cas9 nejprve inhibujete a pak uvolníte, účinnost homologní rekombinace se místo zvýšení trojnásobně sníží, protože buňky se uvolní do nesprávné fáze buněčného cyklu.
A stejně jako při každém úsilí o HDR, říká Corn, vždy proveďte kontrolu bez nukleázy, abyste se ujistili, že náhodou neumnožíte kontaminovanou DNA, která se potuluje po vaší laboratoři. Po zavedení knock-inu „sekvenujte, sekvenujte, sekvenujte, sekvenujte,“ říká. Pouhé použití reportérového systému, jako je značka fluorescenčního proteinu, k prokázání úspěšného vložení genu se může vymstít. Sekvenování ověří, že vložení bylo provedeno na správném místě.
Playing the Long Game
Výzkumník: Channabasavaiah Gurumurthy, ředitel centra pro genomové inženýrství myší, University of Nebraska Medical Center
Projekt: Gurumurthy a jeho kolegové před několika lety přemýšleli nad obtížemi při vkládání genů do myších zygot a zároveň se o to pokoušeli.
Výzkumníci úspěšně vkládali krátkou jednořetězcovou DNA, tak proč nezkusit provést knock-in vložením dlouhé jednořetězcové DNA? Tento přístup, který Gurumurthy nazývá Easi-CRISPR (efficient additions with ssDNA inserts -CRISPR), skutečně zvyšuje účinnost 2,5krát a použití jednořetězcové DNA snižuje míru off-target insercí v buněčné kultuře 100krát (Nat Protoc 13:195-215, 2018; Nature 559:405-09, 2018). „Je to docela obrovské,“ říká. V Gurumurthyho laboratoři Easi-CRISPR vytvořili knock-in myší linii pro 9 z každých 10 genů, které vyzkoušeli. Spolupracovník ji také použil u lidských T-lymfocytů k vytvoření CAR-T buněk, pacientově specifických imunitních buněk pro boj s rakovinou.
Zkuste to: Gurumurthy varuje, že Easi-CRISPR není zdaleka spolehlivý. Někdy technika vloží pouze část genu. Také dodává, že může zakódovat homologická ramena – krátké sekvence na obou stranách genu, které ho vracejí k jeho správnému cíli v genomu. A některé lokusy je nevysvětlitelně obtížnější vložit než jiné.
Málo komerčních dodavatelů navrhuje a syntetizuje vlastní dlouhou jednořetězcovou DNA. Můžete si vyrobit vlastní, ale stabilita jednořetězcové DNA se liší; méně stabilní sekvence budou mít nižší výtěžnost, takže jich možná budete muset syntetizovat více, říká Gurumurthy.
Výzkumníci, kteří nejsou schopni vložit CRISPR do jednobuněčných myších embryí, mohou zaplatit základnímu zařízení, aby vyrobilo myši s jejich sekvencí DNA, říká Gurumurthy. Základní zařízení, jako je to jeho, si za vytvoření jednoho nebo dvou chovných párů účtují 5 000 až 15 000 dolarů; komerční zařízení si podle něj účtují 20 000 až 50 000 dolarů.
Knock-in podle čísel
Výzkumník: Greg Findlay, doktorand v laboratoři Jaye Shendura, Washingtonská univerzita
Projekt: Findlay a jeho kolegové se snažili zlepšit způsob, jakým lékaři interpretují mutace v genu BRCA1 pro rakovinu prsu a vaječníků. Tento gen má tisíce variant, ale vědci nevědí, jak většina z nich ovlivňuje jeho funkci. Ke studiu vlivu těchto variant použili techniku knock-in, kterou vyvinuli a která se nazývá saturační editace genomu (Nature, 562:217-22, 2018).
V imortalizované haploidní lidské buněčné linii použili CRISPR-Cas9 ke knock in 4 000 drobných variant v milionech buněk najednou in vitro. Genom je v každé buňce vyříznut na stejném místě, ale genom každé buňky dostane jinou variantu. Aby podpořili HDR, vyřadili také gen ligázy4, čímž vyřadili opravnou dráhu NHEJ – tento krok přinesl trojnásobné zvýšení účinnosti, říká Findlay. A nakonec, protože se všechny knock-iny buněk liší, provedli hloubkovou sekvenaci buněk, která milionkrát pokryla stejnou genomovou oblast, aby se ujistili, že skutečně vyřadili 4 000 variant, které chtěli studovat. Sekvenovali ve dvou časových bodech a odvodili, že knock-iny, které se neobjevily při sekvenování ve druhém časovém bodě, byly ty, které zasahovaly do funkce genu, protože buňky, které je nesly, musely zemřít.
Zkuste to: Findlayův tým si nechal vyrobit DNA oligos pro 4 000 variant na mikročipu. Můžete si koupit pole o 6 000 až 250 000 oligách, takže zvažte, zda za své peníze nezískáte více peněz kombinací více experimentů na jednom poli, říká Findlay. Jejich laboratoř platí asi 5 000 dolarů za 100 000 olig.
Tato strategie má svá omezení: zatím byla použita pouze k vyřazování jednonukleotidových variant a všechny úpravy musí být ve stejném genu. Metoda funguje nejlépe při editaci poměrně úzké oblasti DNA, asi 110-120 párů bází, protože delší oligosy DNA by obsahovaly příliš mnoho chyb, říká Findlay. Je také důležité sekvenovat velmi hluboko, abyste se ujistili, že zohledníte plný počet variant, které jste zamýšleli vyřadit.