Mechanism of synergistic actin filament pointed end depolymerization by cyclase-associated protein and cofilin

DNA constructs

Všechny myší proteiny N-CAP, N-CAP-GFP, CAP1 v plné délce, HFD doména, GST-fúze HFD domény a C-koncová ADF-H doména twinfilinu, byly klonovány do bakteriálního expresního vektoru pSUMOck4 (laskavý dar od Inari Kursula, University of Bergen, Norsko) za účelem exprese fúzního proteinu označeného SUMO, který po štěpení proteázou SENP2 zanechává nativní N-konec. Pro konstrukty s doménou CARP a C-CAP jsme použili bakteriální expresní vektor pCoofy18 (laskavý dar od společnosti Addgene). Podrobnosti o proteinových konstruktech a primery použité pro klonování konstruktů naleznete v doplňkové tabulce 2.

Exprese a purifikace proteinů CAP a jejich fragmentů

Všechny myší proteiny CAP a jejich fragmenty, s výjimkou CAP1 plné délky, byly exprimovány při teplotě +22 °C v LB autoindukčním médiu (AIMLB0210, Formedium) po dobu 24 h v BL21(DE3) E . coli (od firmy Novagen).

Plná délka myšího CAP1 byla exprimována v LB médiu za použití buněk ArcticExpress (DE3) E. coli. Nejprve jsme inokulovali startovací kulturu obsahující kanamycin (20 µg/ml) a gentamycin (20 µg/ml), která byla inkubována po dobu 6 hodin při teplotě +37 °C. Hlavní kultura o objemu 3,6 l obsahující pouze kanamycin (20 µg/ml) byla inokulována a kultivována na OD600 ~0,4 při teplotě +37 °C třepáním při 240 otáčkách za minutu. Teplota kultivace byla změněna na +13 °C po dobu 1 h před expresí proteinu, která byla indukována přidáním 0,26 mM IPTG po dobu 46 h. Všechny bakteriální pelety byly shromážděny centrifugací, resuspendovány v 50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 25 mM imidazolu, pH 7,5, rychle zmraženy tekutým N2 a uloženy při -80 °C.

Všechny proteiny CAP a doména ADF-H twinfilinu byly purifikovány pomocí podobného pracovního postupu. Nejprve byly bakterie lyzovány sonikací v přítomnosti lysozymu (0,5 mg/ml), DNAse (0,1 mg/ml) a inhibitorů proteáz (200 µg/ml PMSF, 1 µg/ml leupeptinu, 1 µg/ml aprotininu, 1 µg/ml pepstatinu A; vše od firmy Sigma-Aldrich) a lyzát byl vyčištěn centrifugací. Supernatant byl vložen do 1 ml kolony HisTrap HP Ni-NTA (GE Healthcare) a intenzivně promyt (>20 objemů kolony) pomocí 50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 25 mM imidazolu, pH 7,5. Poté se kolona promyla. Protein byl eluován gradientem 25-250 mM imidazolu na zařízení AKTA Pure (GE Healthcare). Vrcholové frakce byly sloučeny a pro odstranění značky SUMO byla přidána proteáza SENP2 na konečnou koncentraci 40 µg/ml. Směs byla dialyzována O/N při 4 °C pomocí dialyzační hadičky SnakeSkin v 1 l 20 mM HEPES, 300 mM NaCl, 2 mM DTT, pH 7,4 pufru. Následující den byly odštěpené SUMO-značky odstraněny pomocí Ni-NTA agarosových kuliček (Qiagen) v případech, kdy byly SUMO-značka a odštěpený protein stejně velké. Proteiny byly zkoncentrovány pomocí odstředivého filtru Amicon Ultra-4 10 kDa (Merck) a vloženy do gelové filtrační kolony HiLoad 16/600 Superdex 200 (GE Healthcare) ekvilibrované v 5 mM HEPES, 100 mM NaCl, 1 mM DTT, pH 7,4. Kolona byla zkoncentrována a následně zkoncentrována. Vrcholové frakce byly shromážděny, zahuštěny a zmrazeny rychlým zmrazením v N2 pro skladování při teplotě -80 °C.

Plná délka CAP byla purifikována s následujícími výjimkami. Místo 1 ml kolony HisTrap HP Ni-NTA jsme použili 5 ml kolonu. Po dialýze a gelové filtraci pomocí gelové filtrační kolony HiLoad 16/60 Superdex 200 byly hlavní frakce píků prohnány přes gelovou filtrační kolonu Superose 6 increase 10/300 GL, aby se získala lepší separace směsi oligomerních stavů. Nakonec byly hlavní píky z několika běhů spojeny, zahuštěny při 5minutových spinových intervalech pomocí odstředivého filtru Amicon Ultra-4 30 kDa a uloženy, jak je uvedeno výše. Proteiny CARP a C-CAP byly purifikovány stejně jako výše s výjimkou použití proteázy 3C (0,01 mg/ml) pro štěpení značek.

Jiné proteiny

Králičí svalový aktin, značené aktiny, profilin, myší kofilin-1, uzavírací protein a biotin-gelsolin byly připraveny podle popisu v ref. 16. ADP-aktin byl připraven podle popisu v ref. 34. Stručně řečeno, 30 µM roztok ATP-G-aktinu obsahující 0,3 mM glukosy a 1 jednotku/ml hexokinasy (Sigma) byl dialyzován proti nukleotidovému výměnnému pufru (5 mM Tris-HCl, 0,1 mM MgCl2, 0,05 mM EGTA, 0,2 mM ADP, 1 mM DTT, pH 8,0) po dobu 4 hodin při 4 °C. Všechny experimenty byly provedeny s použitím králičího svalového α-aktinu.

Aktinové testy depolymerizace špičatého konce

Měření rychlosti depolymerizace špičatého konce aktinových vláken bylo provedeno pomocí mikrofluidního zařízení spárovaného s mikroskopickou sestavou, jak je popsáno16. Stručně řečeno, připravili jsme komůrku s polydimetylsiloxanem (PDMS, Sylgard), která byla upevněna na očištěném krycím sklíčku. Mikrofluidní komůrky měly výšku 20 µm. Tři vstupy a výstup byly napojeny na tlakově řízené trubičky naplněné roztoky různého biochemického složení (mikrofluidní zařízení Fluigent).

Po montáži byly komůrky propláchnuty dH20 a F-pufrem (5 mM HEPES pH 7,4, 100 mM KCl, 1 mM MgCl2, 0,2 mM EGTA, 0,4 mM CaCl2, 0,2 mM ATP, 10 mM DTT a 1 mM DABCO). Poté byla komora postupně vystavena působení: 150 µl 0,1% biotin-BSA v F-pufru; 300 µl 5% BSA; 150 µl 3 µg/ml neutravidinu v F-pufru; a 10-100 µl 1-3 pM biotin-gelsolinu. Před experimenty byla aktinová vlákna polymerizována (8 µM, >30 min) v F-pufru. Frakce aktinových monomerů byla označena Alexa-488 nebo 568. Filamenta byla nakonec vstříknuta do komůrky a ukotvena ke krycímu sklíčku pomocí gelsolinů do požadované hustoty.

Pro měření rychlosti depolymerizace špičatých konců zdobených kofilinem byla filamenta nejprve nasycena 2 µM kofilinu a vystavena 2 µM kofilinu doplněného různými proteiny CAP. Rychlost depolymerizace byla analyzována pomocí programu ImageJ, přičemž pro každé vlákno byl nejprve vytvořen kymograf (funkce reslice) a ručně dosazen sklon podél špičatého konce. Filamenta, jejichž špičaté konce nebylo možné jasně sledovat nebo u nichž byly možné (ne)pozorované pauzy53 či události oddělování, byla z analýzy vyřazena.

Pro minimalizaci vlivu značení proteinů na naše měření jsme použili buď 10%, nebo 16% frakci značení aktinu v závislosti na mikroskopickém uspořádání. V našich experimentech jsme nepozorovali vliv frakce značení na aktivitu N-CAP. Všechny experimenty byly prováděny při pokojové teplotě v uspořádání bez regulace teploty.

Odžíhání aktinových filament

Připravené roztoky F-aktinu v ustáleném stavu (v F-pufru) s různými fluorescenčními značkami byly smíchány a inkubovány za účelem kvantifikace odžíhání. Smíšený roztok obsahoval 4 µM Alexa568-aktinu (značeného 10 %) a 4 µM Alexa488-aktinu (značeného 10 %), s N-CAP a mutanty nebo bez nich. Po 4 minutách při pokojové teplotě byl smíšený roztok F-aktinu zředěn 100× v pufru doplněném 0,2% methylcelulózou a přetekl do otevřené komůrky vyrobené pomocí oboustranné pásky vložené mezi dvě krycí skla a pasivované BSA. Série snímků (interval 2 s) byly pořízeny nejméně ve třech různých zorných polích. Byl spočítán počet zelených (Alexa488) segmentů F-aktinu a počet těchto segmentů, které byly spojeny s červeným (Alexa568) segmentem F-aktinu, aby bylo možné určit poměr dvou barevných segmentů vynesených na obr. 2f. Sledování difúze filament nám umožnilo jednoznačně určit, kdy byly dva segmenty spojeny. Kontroly (bez N-CAP ve směsi F-aktinu) byly opakovány několikrát a experimenty (s N-CAP nebo mutanty) nejméně dvakrát.

Aktinové testy oddělování

Pro zkoumání vlivu N-CAP na oddělování kofilinem jsme použili dvě různé metody, buď (1) měřením podílu jednotlivých kofilinových domén, které ještě nevedly k oddělování, nebo (2) kvantifikací globálního počtu případů oddělování na µm aktinového vlákna.

(1) Oddělování spojené s jednotlivými kofilinovými doménami (doplňkový obr. 3c). Postupovali jsme podle dříve popsaného postupu16. Stručně řečeno, uvnitř mikrofluidní komůrky bylo polymerováno 12 % aktinových filament značených Alexa-488 ze spektrin-aktinových semen, nespecificky ukotvených na krycím sklíčku pasivovaném BSA. Filamenta byla 15 min stárnuta roztokem G-aktinu o kritické koncentraci (100 nM G-aktinu), takže filamenta se stala >99 % ADP46. Poté byla filamenta kontinuálně vystavena působení samotného 500 nM mCherry-kofilinu-1, 2 µM CAP1 plné délky nebo 10 µM N-CAP. V programu ImageJ pak byly sestrojeny kymografy filamentů, na nichž bylo možné sledovat nukleaci a sestavení jednotlivých kofilinových domén a události oddělování na rozhraní s holými aktinovými segmenty.

Pro každou doménu byl čas 0 definován na snímku, na kterém nukleovala. Poté jsme zaznamenali buď čas, kdy vyvolaly událost oddělování, nebo kdy se ztratily v důsledku oddělování jinou doménou, slučování nebo cenzurní události. Podíl domén, které nevyvolaly událost oddělování, byl poté vypočten pomocí klasické Kaplanovy-Meierovy metody.

(2) Celkový počet událostí oddělování/µm (doplňkový obr. 3d). Uvnitř průtokových komor (mezi dvěma krycími sklíčky vzdálenými od sebe oboustrannou páskou) jsme nejprve vstříkli předpolymerizovaná filamenta značená Alexa-488 (v F-pufru, s 0,2-0,3 % metylcelulózy). Poté byl roztok vyměněn za 500 nM neznačeného kofilinu-1 a 0, 1 nebo 10 µM NCAP. Po výměně byla filamenta, která zůstala u povrchu, analyzována následujícím způsobem.

Počet událostí přerušení na µm byl vypočten jako kumulativní funkce

kde Nsev(u) je počet oddělujících událostí v čase u a \(\mathop {\sum}\nolimits_i {l_{i(u)}}\) je součet za všechna vlákna i jejich délky v čase u. Protože roztok neobsahuje G-aktin, filamenta se depolymerizují, a délka filament tak v čase klesá.

Vazba N-CAP na špičaté konce filament

Experiment byl proveden v průtokových komorách (viz Actin severing assay (2)), pasivovaných biotinem-PLL-PEG a funkcionalizovaných neutravidinem. F-aktin (10 % Alexa-568, 1 % biotinu) byl polymerizován přes noc při 4 µM. Těsně před vstříknutím do komory byl F-aktin zředěn na 200 nM a smíchán se 100 nM N-CAP-GFP, 2 µM kofilinu-1 a 4 nM uzavíracího proteinu v F-pufru doplněném 0,2% methylcelulózou. Snímky aktinových filament byly pořízeny před a po proudovém snímání kanálu GFP (5 snímků za sekundu po dobu 12 s, mikroskopie TIRF). Pro analýzu vazby na konce filament byla slepě vybrána aktinová filamenta, která se během proudového snímání nepohybovala. Fluorescence byla měřena na obou koncích každého filamentu na ploše 3 x 3 pixely. Vazbová událost byla detekována, když fluorescence překročila libovolný práh (stejná hodnota pro všechna filamenta a konce filament). Vzhledem k tomu, že uzavírací protein by měl chránit ostnatý konec, byl špičatý konec přiřazen k tomu s největším počtem vazebných událostí. N-CAP-GFP byl detekován v 17 % datových bodů na špičatém konci filamentu, zatímco nespecifická asociace N-CAP-GFP v blízkosti ostnatého konce filamentu byla detekována v 1,7 % datových bodů. Poté byla vypočtena frakce přežívání N-CAP na špičatém konci a přizpůsobena jedné exponenciále pro měření rychlosti nevázání.

Krystalizace a určení struktury

Myší HFD doména byla krystalizována s přítomností 10×His-tag a purifikována, jak je popsáno výše, s výjimkou použití 5 mM HEPES, 50 mM NaCl, 0,2 mM DTT, 0,01% NaN3, pH 7,5 pufru při gelové filtraci. Vzorek byl před krystalizací koncentrován na 7-10 mg/ml a smíchán v poměru 1:1 s 0,1 M kakodylátem sodným, 12% PEG4000 (w/v), pH 6,1 metodou sedící kapky o velikosti 200 nl ve formátu 96 jamek. Po 2 týdnech inkubace byly pozorovány velké jehlicovité krystaly. Pro dálkový sběr dat na Diamond Light Source (UK, Didgot) na beamline I03 byly krystaly kryochráněny namočením do matečné kapaliny obsahující 25 % glycerolu a zmrazeny v N2 pro přepravu na beamline. Data byla shromážděna při 100 K za použití vlnové délky 0,9763 Å, detektoru Pilatus3 6M, 30% přenosového výkonu, expozice 0,05 s a úhlu oscilace 0,1° jako celkem 2400 snímků. Difrakční data byla integrována a škálována pomocí softwaru XDS (X-ray Detector Software)54 . Počáteční řešení bylo získáno pomocí molekulární náhrady s použitím programu PHASER55 a PDB = 1s0p jako vyhledávacího modelu. Bylo nalezeno řešení se čtyřmi doménami HFD přítomnými v asymetrické jednotce, po němž několik kol zpřesňování pomocí programu BUSTER56 a ruční sestavování v programu COOT57 přineslo dobrou shodu s daty (viz tabulka 1). Dalšího zlepšení bylo dosaženo zjemněním dat zavedením translačně-liberačně-šroubových parametrů (1/řetězec), odstraněním nekrystalografických omezení a modelováním individuálního atomového B-faktoru. Konečná hodnota Rwork/Rfree pro model byla 18,6 %/23,0 % s dobrou celkovou geometrií.

Pro krystalizaci trojkomplexu (ADP-aktinu, HFD domény myšího CAP1 a C-terminální ADF-H domény myšího twinfilinu-1) byl ADP-aktin připraven v O/N dialýze při +4 °C v 5 mM HEPES, 0..2 mM MgCl2, 0,2 mM ADP, 0,2 mM EGTA, 0,3 mM glukózy, 0,5 mM β-merkaptoethanolu, pH 8,0. Roztok aktinu obsahující 0,3 mM glukózy a 5 U/ml hexokinázy byl přenesen na dialyzační membránu Slide-A-Lyser a umístěn na plovoucí zařízení při +4 °C. Druhý den před tvorbou komplexu byl aktin centrifugován 20 min při 355 040 × g pomocí rotoru TLA-120. Proteiny byly smíchány v poměru 1:1,1:1,1 (aktin, HFD doména, ADF-H doména), zahuštěny na 10-20 mg/ml a použity ke krystalizaci, jak je uvedeno výše. Hity byly získány z několika různých podmínek a nejlépe difraktující krystal byl získán při koncentraci ~10 mg/ml komplexu smíchaného 1:1 v 0,1 M HEPES, 0,1 mM KCl, 10% PEG4000 (w/v), pH 7,0 s velikostí sedací kapky 200 nl. První den se v kapce objevilo několik malých krystalů ve tvaru kosočtverce. Třetí den se objevil velký tyčinkovitý krystal, zatímco všechny malé krystaly byly rozpuštěny. Pro dálkový sběr dat na Diamond Light Source (UK, Didgot) na beamline I03 byly krystaly kryochráněny namočením do LV CryoOil (MiTeGen) a pro přepravu zamraženy v N2. Data byla shromážděna při 100 K za použití vlnové délky 0,9762 Å, detektoru Pilatus3 6M, 20% přenosového výkonu, expozice 0,05 s a úhlu oscilace 0,15° jako celkem 2400 snímků. Difrakční data byla integrována a škálována pomocí XDS54. Počáteční řešení bylo získáno pomocí molekulární náhrady s použitím PHASER55 a PDB = 3daw jako vyhledávacího modelu, který ukázal jasnou extra hustotu ve špičatém konci aktinového monomeru. Proto byla provedena další molekulární záměna a pomocí BALBES58 byl získán počáteční model trojčlenného komplexu s 3daw a 1s0p jako vyhledávacími modely. Tím bylo získáno řešení s Q = 0,787 a Rwork/Rfree = 29,7 %/35,6 %. Asymetrická jednotka obsahovala jediný komplex 1:1:1 HFD:ADF-H:ADP-aktin. Ke zlepšení modelu bylo zapotřebí několika kol zpřesňování pomocí programu BUSTER56 a ručního sestavování v programu COOT57 , zejména přestavby smyčky D a spojovacích smyček α-heliků v doméně HFD. Nakonec přidání vody, zavedení parametrů translačně-libračního šroubovice (1/řetězec) a modelování jednotlivých atomárních B-faktorů přineslo model s konečnou hodnotou Rwork/Rfree 16,6 %/19,4 % s dobrou celkovou geometrií.

Zkoumání interakcí protein-protein pomocí gelové filtrace

Pro studium vazby monomerů aktinu byl ADP-G-aktin připraven podle popisu v ref. 34. Všechny experimenty s gelovou filtrací byly prováděny při teplotě +4 °C s rychlostí chodu 0,5 ml/min a frakcionací 0,5 ml s gelovou filtrační kolonou Superdex 200 increase 10/300 GL ekvilibrovanou v 5 mM HEPES, 100 mM NaCl, 0,1 mM ADP, 0,1 mM MgCl2, 1 mM DTT, pH 7,4. Zkoušky byly prováděny při teplotě +4 °C s rychlostí chodu 0,5 ml/min a frakcionací 0,5 ml. Na kolonu bylo vstříknuto sto mikrolitrů komplexu obsahujícího 18 µM ADF-H domény twinfilinu, 15 µM ostatních proteinů a analyzována eluce. Vrcholové frakce byly rovněž analyzovány pomocí SDS-PAGE. Konkurenční experimenty s monomery aktinu byly provedeny stejně jako výše, přičemž do vzorků bylo přidáno 15 µM domény C-CAP nebo CARP. Vrcholové frakce byly analyzovány na SDS-PAGE, gely byly zobrazeny pomocí zobrazovacího systému ChemiDoc XRS+ (Bio-Rad) a kvantifikovány pomocí programu Image Lab (Bio-Rad).

Nativní-PAGE

Mini-Protean TGX 10% gely (Bio-Rad) byly před zatížením předem ponechány v chlazeném běžícím pufru (25 mM Tris, 195 mM glycin, 0,5 mM ADP, 0,1 mM MgCl2, pH 8,5) po dobu 1 hodiny. Vzorky byly připraveny v ADP-aktinovém dialyzačním pufru (5 mM HEPES nebo Tris, 0,1 mM MgCl2, 0,1 mM EGTA, 0,2 mM ADP, 0,3 mM glukóza, 0,1 mM DTT, pH 8.).0) v koncentraci 20 µM každého proteinu, smíchané v poměru 1:1 s 2× nakládacím pufrem (běžící pufr obsahující 20 % glycerolu, bromfenolovou modř, bez ADP nebo MgCl2) a poté nanesené v objemu 5 µl do jamek pro vzorky o objemu 50 µl. Gely byly spuštěny při 100 V na ledu po dobu 4 h.

Fluorometrický test rozkladu aktinových vláken

Rozklad ADP-aktinových vláken v ustáleném stavu byl proveden následujícím způsobem: 5% pyren-aktin byl polymerizován ve 20 mM HEPES, 100 mM NaCl, 1 mM MgCl2, 1 mM ATP, 1 mM DTT, pH 7,4 po dobu 60 min. Ostnaté konce vláken byly uzavřeny 50 nM uzavíracího proteinu. Následně bylo přidáno 0,5 µM kofilinu (a 0,5 µM N-CAP) a reakce byla zahájena přidáním 4 µM vazebného proteinu vitaminu D (sekvestrátor monomerů). Konečná koncentrace aktinu byla 2,5 µM. Rozklad aktinu byl měřen sledováním fluorescence pyrenu s excitací při 365 nm a emisí při 407 nm na fluorescenčním spektrofotometru (Agilent) po dobu 2400 s při 22 °C.

CD spektrometrie

CD spektra pro divoký typ N-CAP, mutanty a doménu HFD byla měřena při 20 °C pomocí spektropolarimetru J-720 (Jasco), v 300 µl křemenné kyvetě o délce světelné dráhy 0,1 cm s následujícími parametry: režim pokračujícího skenování s rychlostí skenování 50 nm/min, šířka pásma 0,5 nm, vlnový rozsah 190-260 nm, rozteč dat 0,5 nm. Všechny proteiny byly zředěny na 15 µM 10% pufrem PBS. Kumulace deseti skenování pro každý protein byla vynesena jako jedna křivka.

Modely pro atomistické MD simulace

Modely aktinu zdobeného kofilinem byly založeny na struktuře kryoelektronové mikroskopie s rozlišením 3,8 Å (PDBID: 5YU8)41 . Chybějící smyčky byly sestaveny pomocí RosettaCM59 a RosettaScripts60 za přítomnosti mapy elektronové hustoty41 ukládající související šroubovicovou symetrii. Aby odpovídaly experimentálním konstruktům v této práci, byly v této fázi změněny sekvence aktinu a kofilinu z kuřecích na králičí, respektive myší. Bylo vytvořeno více než 1000 modelů. Poté byly seřazeny podle celkového skóre a ty, které obsahovaly strukturní artefakty (např. cis peptidové vazby), byly odfiltrovány. Ze tří nejlépe hodnocených modelů byly zahájeny simulace molekulární dynamiky (MD) (Doplňková tabulka 1, simulace F1-3).

Komplex HFD-aktin byl izolován z krystalizovaného komplexu HFD doména/aktin/dvojče ADF-H domény a samostatně dokován na vybrané modely aktinových vláken zdobených kofilinem popsané výše. Za tímto účelem byl izolovaný HFD-aktin superponován na každý monomer aktinu se špičatým koncem, který byl poté nahrazen HFD-aktinem. Tímto způsobem se konformace krystalové struktury dimeru aktinu-HFD přenesla na špičku aktinu zdobeného kofilinem. Dokované modely byly nejprve lokálně zpřesněny pomocí dokovacího protokolu61 a poté následovala omezená relaxace pomocí protokolu fast relax62 distribuovaného se softwarovou sadou Rosetta. Tento postup byl použit zvlášť pro každé aktinové vlákno zdobené kofilinem vybrané pro MD simulace (doplňková tabulka 1, simulace C1-3).

Konstrukce špičatého koncového segmentu pro MD simulace

Každá simulace byla provedena na špičatém koncovém segmentu vybraného modelu aktinového vlákna zdobeného kofilinem, který byl vytvořen rozříznutím modelu kolmo na osu vlákna. Rovina řezu byla zvolena tak, aby do úseku byly zahrnuty čtyři celé monomery aktinu vázané na ADP-Mg2+ a tři celé monomery kofilinu (doplňková tabulka 1, simulace F1-3). Segment obsahoval také dvě domény HFD na špičatém konci v systémech vázaných na HFD (Doplňková tabulka 1, simulace C1-3). Segment se špičatým koncem obsahoval také několik polypeptidových fragmentů kofilinů a aktinů na svém ostnatém konci (doplňkový obr. 5a). Aby se během simulací zachovala jejich konformace a poloha, byly tyto přetržené řetězce po celou dobu simulací udržovány polohově omezené následujícím způsobem: Všechny těžké atomy v blízkosti roviny krájení a pouze páteřní těžké atomy pro oblasti mezi nimi byly omezeny silovou konstantou 100 kJ/mol/nm2 (doplňkový obr. 5a). Tyto částečně omezené polypeptidové fragmenty na ostnatém konci fungují během simulací jako platforma. Tento přístup zachovává jak rozhraní protein-protein podobné vláknu na ostnatém konci, tak orientaci vlákna během simulací.

Protonační stavy zbytků byly určeny při neutrálním pH na základě výpočtů pKa pomocí programu PROPKA363. Každý aktinový zbytek H73 byl metylován (Nτ-metyl-l-histidin, HIC) a N-konce aktinu, kofilinu a HFD byly acetylovány. Topologie pro každou molekulu v systémech byla připravena pomocí programu LeAP distribuovaného s nástrojem ambertools1864, které byly následně převedeny do formátu GROMACS pomocí nástroje ParmEd.

Každý špičatý koncový řez vytvořený z vybraných modelů byl umístěn do simulačního boxu se šestiúhelníkovým hranolem, jehož dlouhá osa byla zarovnána s osou z.

. Rozměry krabice byly zvoleny tak, aby minimální vzdálenost mezi vláknem a každou stěnou krabice byla přibližně 17 Å (Doplňková tabulka 1). Každý systém byl solvatován 0,15 M roztokem NaCl s počty iontů upravenými tak, aby se systém neutralizoval.

Před výrobními běhy byla provedena minimalizace s nejstrmějším sestupem a postupné krátké ekvilibrační simulace (celkem ~7 ns) v sestavách NVT a NpT s použitím Berendsenova termostatu a barostatu65. Během těchto ekvilibračních simulací byla na špičatý koncový řez aplikována harmonická polohová omezení. Menší skupina atomů (všechny těžké atomy, páteř proteinu a nakonec pouze atomy Cα) byla v každé následující ekvilibrační simulaci omezena silovou konstantou 1000 kJ/mol/nm2.

Systémy, které byly rozvětveny od ostatních (Doplňková tabulka 1; C1′, C2′. F2′) byly připraveny provedením vhodné úpravy (dokování nebo odstranění domén HFD), odstraněním překrývajících se molekul rozpouštědla (při dokování domén HFD) a opětovným nastavením velikosti boxu a atomů rozpouštědla pro novou velikost systému. Byla provedena postupná NVT a NpT ekvilibrace s omezeními, jak je uvedeno výše (celkem ~200 ps pro simulace, kde byly HFD domény odstraněny, a celkem ~4 ns, kde je dokovaná).

Všechny výrobní běhy byly provedeny pro 1-2.5 μs v souboru NpT pouze s výše uvedenými polohovými omezeními na oblast platformy.

Silová pole a parametry v MD simulacích

V MD simulacích byla použita následující silová pole a sady parametrů: Amber ff14sb66 pro proteiny, model TIP3P67 pro vodu, sada parametrů monovalentních iontů podle Jounga a Cheathama68 pro Na+ a Cl-, oktaedrický model vícemístných iontů podle Saxeny a Septa69 pro Mg2+ a sada parametrů polyfosforylovaných sloučenin podle Meaghera a spol.70 pro ADP. Chybějící vazebné parametry pro methyl-histidin (Nτ-Methyl-l-histidin, HIC) byly převzaty ze silového pole GAFF264. Atomové náboje byly vypočteny podle protokolu Duana a spol.71 Software R.E.D.III.572 byl použit pro fitování multikonformního omezeného elektrostatického potenciálu (RESP) s použitím prodloužené a α-helikální konformace dipeptidu HIC (Ace-HIC-Nme). Všechny kvantově-chemické výpočty byly provedeny pomocí sady programů Gaussian0973 na úrovni teorie b3LYP/cc-pVTZ. Nábojové výpočty byly provedeny pomocí modelu IEFPCM v polarizovatelném kontinuu s dielektrickou konstantou 4 při nastavení rozpouštědla jako éteru.

MD simulační protokoly

Všechny simulace byly provedeny pomocí GROMACS 201874. Pohybové rovnice byly integrovány pomocí skokového algoritmu s časovým krokem 2 fs. Všechny vazby byly omezeny pomocí algoritmu LINCS75. Simulační protokoly byly zvoleny podle ref. 66. Elektrostatické interakce dlouhého dosahu byly ošetřeny pomocí Ewaldova schématu hladké sítě částic76 s odříznutím reálného prostoru 0,8 nm, Fourierovou vzdáleností 0,12 nm a interpolací čtvrtého řádu. Pro van der Waalsovy interakce byl použit Lennard-Jonesův potenciál s mezní hodnotou 0,8 nm. Pro energii a tlak byly použity korekce disperze na dlouhé vzdálenosti77.

Všechny simulace produkce byly provedeny v souboru NpT. Špičatý koncový plátek, platforma a rozpouštědlo (voda a 0,15 M NaCl) byly spojeny s oddělenými teplotními lázněmi o teplotě 310 °K pomocí Nosé-Hooverova termostatu78,79 s časovou konstantou 1,0 ps. Izotropní tlakové spojení bylo provedeno pomocí Parrinello-Rahmanova barostatu80 s referenčním tlakem 1 atm, časovou konstantou 5 ps a stlačitelností 4,5 × 10-5 bar-1.

Analýza MD simulací

Všechny analýzy byly provedeny pomocí VMD81 a vlastních skriptů. Výpočty MMGBSA byly provedeny pomocí softwaru MMPBSA.py82 distribuovaného s nástrojem ambertools1864 s využitím modifikovaného modelu GB vyvinutého Onufrievem a spol.83. s koncentrací soli 0,15 M (snímky vzorkovány každých 100 ns s vyřazením prvních 500 ns každé simulace).

Strukturní analýzy

Pro analýzu různých aktinových struktur a jejich konformačních stavů uvedených na obr. 1d jsme postupovali podle protokolu Tanaky a spol.41,84 . s použitím struktury F-aktinu (PDB 6djo) jako reference.

Statistická analýza a reprodukovatelnost

Data na obr. 2d, 4b a 4d byla sdružena z několika experimentů provedených v různých dnech, a představují tak data z několika nezávislých experimentů. Panely 2f, 2g, 2h a 3d představují data analyzovaná z jednoho reprezentativního experimentu. n popisuje počet analyzovaných vláken pro panely 2d, 2f, 2g, 4b a 4d. n v panelu 6c odpovídá počtu opakování experimentu.

Experimenty na doplňkových obr. 2a-d, 3c, 6a-d byly provedeny s podobnými výsledky nejméně dvakrát. Experimenty v obr. 3d, experiment s konkurencí domén CARP v obr. 6a a experimenty za podmínek podporujících sestavení v obr. 7 byly provedeny jednou.

Souhrn zpráv

Další informace o designu výzkumu jsou k dispozici ve zprávě Nature Research Reporting Summary, která je propojena s tímto článkem.