Kmeny Streptococcus pyogenes z těžkých invazivních infekcí se vážou na HEp2 a HaCaT buňky silněji než kmeny z nekomplikovaných infekcí | Journal of Clinical Microbiology těžkých invazivních infekcí vážou HEp2 a HaCaT buňky hojněji než kmeny z nekomplikovaných infekcí

Streptococcus pyogenes (streptokok skupiny A ) je etiologickým původcem různých lidských onemocnění, včetně faryngitidy, pyodermie a závažných invazivních onemocnění. Kromě toho je tento patogen spojován s potenciálně život ohrožujícími následky, jako je poststreptokoková glomerulonefritida a akutní revmatická horečka. V Severním teritoriu (NT) Austrálie je výskyt akutní revmatické horečky mezi domorodým obyvatelstvem velmi vysoký (3), a to i přes nízkou míru izolace GAS v krku. Kromě toho je pyodermie způsobená infekcí GAS velmi častá a poststreptokoková glomerulonefritida je endemická v mnoha odlehlých domorodých komunitách (4, 7). Zatímco asymptomatické nosičství v krku je často uváděným rezervoárem kmenů spojených s invazivním onemocněním (5), v populacích, kde se endemicky vyskytuje impetigo, jako například v domorodých komunitách v NT, je primárním rezervoárem kůže. Bez ohledu na to, která tkáň je primárním místem infekce, první událostí, které musí patogen dosáhnout, je adherence k buňkám hostitele. Genom S. pyogenes kóduje četné geny, které lze považovat za geny kódující adheziny. Tyto geny jsou vysoce regulované a jednotlivé kmeny nemají genetický potenciál kódovat všechny tyto proteiny. Mezi adheziny patří M protein (antifagocytární molekula), kapsida a proteiny vázající fibronektin. Existuje mnoho různých proteinů vážících fibronektin, například SfbI (8, 12), PrtF2 (9, 10), Fbp54 (2) a SfbII (11). Adherenční schopnost jednotlivých kmenů se může lišit v závislosti na repertoáru genů pro adheziny, které kmen vlastní, a na úrovni jejich exprese. To zase může odrážet rozdíly ve schopnosti kolonizovat a trvale infikovat různá místa tkání. Z toho vyplývá, že izoláty z různých tkáňových míst mohou vykazovat rozdíly ve schopnosti adherence. Abychom to ověřili, stanovili jsme míru vazby izolátů GAS z kůže, krku a krve na buněčné linie HEp2 a HaCaT, které představují lidské hrtanové epitelové buňky, resp. keratinocyty.

Izoláty GAS z NT byly shromážděny v letech 1990 až 2002. V této studii bylo analyzováno 72 kmenů izolovaných z krve (n = 26), kůže (n = 22) a hrdla (n = 24) (tabulka 1). Krevní izoláty pocházely z těžkých onemocnění a zbývající kmeny z nekomplikovaných infekcí. Izoláty byly typizovány podle Viru, jak bylo popsáno dříve (6). Typizace viru zahrnuje polymorfismus délky restrikčních fragmentů regulonu mga, který zahrnuje gen pro vysoce variabilní M protein. Aby bylo zajištěno zařazení epidemiologicky nepříbuzných kmenů, byl zařazen jeden reprezentativní izolát od každého typu Vir. Kultury byly kultivovány přes noc při 37 °C na orbitální třepačce do stacionární fáze v bujónu Todd-Hewitt (Oxoid, Basingstoke, Spojené království) doplněném 1% kvasničným extraktem. Pro přípravu inokula GAS pro testy adherence byly jednodenní kultury odstředěny a pelety byly promyty ve fosfátem pufrovaném fyziologickém roztoku (PBS; Life Technologies Gibco BRL, New York, N.Y.) a resuspendovány v médiu RPMI 1640 bez séra a antibiotik (Life Technologies) na optickou hustotu 0,05 při 600 nm. To představuje přibližně 1 × 107 až 1,5 × 107 bakterií na ml.

Lidské hrtanové epitelové buňky (HEp2) byly udržovány v médiu RPMI 1640 doplněném 10% fetálním telecím sérem (Life Technologies), 1% Fungizone (Life Technologies), 20 μg vankomycinu HCl (David Bull Laboratories, Sydney, Austrálie) na ml a 100 μg streptomycin sulfátu (Sigma, St. Louis, Mo.) na ml. Dospělé lidské kožní keratinocyty (buňky HaCaT) byly udržovány v Dulbeccově modifikovaném médiu Eagle (Life Technologies) doplněném 10% tepelně inaktivovaným fetálním telecím sérem. Pro testy adherence bylo ∼105 buněk/ml nasazeno na skleněné krycí sklíčka o průměru 12 mm na dno 24jamkových destiček pro tkáňové kultury (Nunc, Roskilde, Dánsko). Po nočním růstu při 37 °C v 5% atmosféře CO2 byly buňky promyty PBS (pH 7,4) a naočkovány 500 μl inokula GAS. Po 2 hodinách inkubace při 37 °C byla krycí sklíčka pětkrát promyta přidáním 1 ml PBS do každé jamky a po jemném promíchání byl promývací roztok odstraněn odsátím. Po odstranění neadherentních bakterií byly hostitelské buňky a adherentní bakterie fixovány 95% methanolem a vysušeny na vzduchu. Po tepelné fixaci byly krycí sklíčka umístěna na sklíčka a obarvena podle Grama k prohlížení pod olejovou imerzí. V každém experimentu byly analyzovány buňky v několika náhodných polích a přilnavost byla vyjádřena jako průměrný počet řetězců GAS na buňku. Všechny testy byly provedeny ve dvou opakováních a pro každý kmen byla stanovena průměrná vazba. Všechny statistické analýzy byly provedeny pomocí programu Stata Statistics/Data Analysis verze 7.0 (Stata Corporation, College Station, Tex.). Data byla analyzována pomocí t-testů.

Kmeny GAS adherovaly k oběma typům buněk a stupeň vazby se u jednotlivých kmenů lišil (tabulka 1). Mezi nezávislými experimenty s 20 izoláty opakovanými ve dvou časových intervalech byla dobrá korelace (údaje nejsou uvedeny), což naznačuje, že avidita vazby je reprodukovatelná a specifická pro kmen. Celkově je vazba GAS na buňky HaCaT větší než na buňky HEp2 (P < 0,05). Když byly údaje v tabulce 1 rozděleny podle místa izolace tkáně, vázalo se v průměru 270 řetězců kmenů GAS z krve na 50 buněk HaCaT (obr. 1). Naproti tomu izoláty z kůže a krku vázaly v průměru pouze 169 a 178 řetězců na 50 buněk HaCaT. Tyto rozdíly jsou statisticky významné (P = 0,0044, resp. 0,0063). Je zajímavé, že u buněk HEp2 jsou rozdíly méně výrazné a nejsou statisticky významné. Když však byly údaje znovu analyzovány na základě invazivních versus nekomplikovaných infekcí kombinací údajů pro kožní a krční izoláty, byly zjištěny významné rozdíly mezi oběma kategoriemi u obou buněčných linií (P = 0,0011 pro HaCaT; P = 0,0238 pro HEp2).

Dřívější práce této laboratoře ukázala, že mnoho běžně cirkulujících kmenů S. pyogenes může způsobit invazivní onemocnění s kůží jako primárním místem infekce (1). Tato pozorování jsou v souladu se současnými nálezy vyšší avidity NT kmenů GAS pro buněčné linie HaCaT než HEp2 a krevní izoláty jsou schopny se vázat ve větším počtu než izoláty z nekomplikovaných infekcí. Možné vysvětlení vysoké náchylnosti krevních izolátů S. pyogenes k adherenci zahrnuje genotypové i fenotypové rozdíly mezi izoláty z invazivních a neinvazivních zdrojů onemocnění. K definování povahy této vazebné avidity a určení, zda je konzistentní v rámci klonálních populací, jsou zapotřebí další studie.