In vivo snížení RyR1 ve svalu vyvolává myopatii podobnou jádru

Generace RyR1Flox/Flox::HSA-Cre-ERT2

Myší linie s místy loxP vloženými na obou stranách exonů 9-11 genu RYR1 (tzv. RyR1Flox/Flox) byla spárována s myší linií HSA-Cre-ERT2 exprimující tamoxifen dependentní rekombinázu Cre-ERT2 pod kontrolou genu α-aktinu lidského kosterního svalu , aby vznikla linie RyR1Flox/Flox::HSA-Cre-ERT2. Injekce tamoxifenu indukuje aktivaci rekombinázy Cre-ERT2 selektivně v kosterním svalu, což vede k deleci exonů 9-11 a přerušení genu RYR1 v kosterním svalu s přísnou závislostí na tamoxifenu (obr. 1a). Při narození byly RyR1Flox/Flox::HSA-Cre-ERT2 myši normální a ve věku 2 měsíců, kdy už byly mladé dospělé, byla rekombinace vyvolána injekcí tamoxifenu (od tohoto okamžiku se rekombinovaná zvířata nazývají RyR1-Rec). Molekulární a fyziologické důsledky byly dále studovány v závislosti na čase, a to až do 105 dnů po indukci rekombinace (obr. 1b). Kontrolní zvířata (CTRL) jsou vrstevníci RyR1Flox/Flox (bez transgenu HSA-Cre-ERT2), kterým byl aplikován tamoxifen. Celkový fenotyp rekombinovaných myší v 75 dnech je charakterizován kyfózou spojenou s abnormální pohyblivostí zadních končetin a vrávoravou chůzí. Zvířata jsou stále schopna postavit se na zadní nohy, aby se nakrmila, ale s postupujícím onemocněním jim byly systematicky podávány krmné granule přímo do klece. Ve 105 dnech jsou zvířata stále pohyblivá v kleci a nebyla pozorována zvýšená úmrtnost ve srovnání s CTRL. Postiženi byli samci i samice. Relativní množství RyR1 na úrovni mRNA bylo analyzováno ve čtyřhlavém svalu stehenním každých 15 dní po rekombinaci pomocí RT-q-PCR u zvířat CTRL a RyR1-Rec (obr. 1c). Byl pozorován rychlý pokles mRNA RyR1, přičemž nízké a stabilní hladiny 21 % ± 4 % původní hodnoty bylo dosaženo již 3 dny po injekci tamoxifenu. Snížení bylo pozorováno ve všech testovaných svalech 75 dní po indukci rekombinace (Quadriceps, tibialis anterior, EDL, soleus, Additional file 1: Obr. S1A). Množství proteinu RyR1 bylo dále analyzováno pomocí kvantitativního Western blotu v homogenátech čtyřhlavého svalu (obr. 1d, e). Toto množství se postupně snižovalo a po 105 dnech dosáhlo přibližně 50 % původní hodnoty. Při delší době nebylo pozorováno další snížení proteinu RyR1 (údaje nejsou uvedeny). Množství proteinu RyR1 bylo kvantifikováno v různých svalových homogenátech 75 dní po rekombinaci. Snížení bylo pozorováno ve všech testovaných svalech, ačkoli zbývající množství se mezi svaly mírně lišilo, přičemž nejvyšší bylo v interosseu (64 % ± 5 %) a nejnižší v soleu (33 % ± 5 %) (Additional file 1: Fig. S1B).

Myši RyR1-Rec vykazují progresivní snížení svalové a tělesné hmotnosti a svalové síly

Důsledky snížení RyR1 byly nejprve studovány na úrovni celého zvířete. Zpočátku při stejné hmotnosti zvířata CTRL pomalu přibývala na hmotnosti z 24,4 ± 0,4 na 30,6 ± 0,8 g v D90, zatímco zvířata RyR1-Rec postupně ztrácela hmotnost na 20,6 ± 1,3 g v D90 (obr. 2a). Postižení samci i samice ztratili po 75 dnech přibližně 13 % své původní tělesné hmotnosti (Additional file 1: Fig. S1C). To je důsledek úbytku hmotnosti pozorovaného ve všech svalech (Additional file 1: Fig. S1D). Pro testování celkové výkonnosti svalů po redukci RyR1 byla zvířata podrobena dvěma různým silovým testům. Nejprve jim bylo umožněno viset při uchopení zkříženého povrchu všemi čtyřmi tlapami až 5 min, přičemž latence do pádu odrážela svalovou sílu. Test úchopu prováděný každý týden po dobu 105 dní (obr. 2b) ukázal, že zvířata s RyR1-Rec začala ztrácet sílu 20-30 dní po injekci tamoxifenu, kdy množství RyR1 činilo asi 75-80 % původní hodnoty, a nebyla schopna viset na mřížce asi 75 dní po injekci tamoxifenu, protože množství RyR1 dosáhlo úrovně asi 60 %. Svalová síla byla rovněž hodnocena pomocí 6minutového protokolu neinvazivní elektrostimulace svalu gastrocnemius spojeného s anatomickou magnetickou rezonancí (MRI) v celkové anestezii. Během elektrostimulačního protokolu CTRL zvířat 30 dní po injekci tamoxifenu (obr. 2c, D30) byl zaznamenán typický profil cvičení se stabilní počáteční svalovou silou, která pomalu klesala s únavou svalu. U skupiny CTRL v D60 a D90 vykazoval profil cvičení zlepšení svalové síly při stárnutí zvířat (obr. 2c). Naproti tomu výkonnost zvířat RyR1-Rec se podobně jako u CTRL v D30 s věkem zhoršovala. Zvířata RyR1-Rec již nebyla schopna provádět cvičení v D90 (obr. 2c, RyR1-Rec D90). Objem gastrocnemia měřený pomocí MR snímků (obr. 2d) zůstal u zvířat CTRL stabilní od D30 (161 ± 5 mm3) do D90 (164 ± 4 mm3). Naproti tomu u myší RyR1-Rec byl objem gastrocnemiusu od D30 významně menší než u myší CTRL (141 ± 3 mm3, p = 0,003) a dále se zmenšil až na 100 ± 3 mm3 v D60 (p < 0,001 ve srovnání s CTRL ve stejném věku) a 69 ± 4 mm3 v D90 (p < 0,001 ve srovnání s CTRL ve stejném věku). Maximální specifické záškubové napětí (absolutní záškubové napětí normalizované k objemu svalu) potvrzuje, že obě skupiny vykazovaly v D30 podobnou svalovou sílu (obr. 2e), ale u zvířat RyR1-Rec síla dramaticky klesala, zatímco u zvířat CTRL s přibývajícím věkem rostla. Kromě toho byly v D60 neinvazivně hodnoceny změny bioenergetiky svalu gastrocnemius během elektrostimulace pomocí in vivo 31-fosforové (31P) MR spektroskopie. Zatímco bazální intramyofibrilární pH se mezi oběma skupinami nelišilo (Additional file 1: Fig. S2A), rozsah acidózy na konci cvičení byl nižší (p = 0,016) u zvířat s RyR1 Rec (Additional file 1: Fig. S2B), což naznačuje, že glykolytický tok ve cvičícím svalu byl u těchto zvířat snížen. Kromě toho byla časová konstanta resyntézy fosfokreatinu po cvičení (τPCr) u myší RyR1-Rec významně kratší (p = 0,047) (doplňkový soubor 1: obr. S2C, D), což odráží zlepšenou funkci mitochondrií in vivo. Syntéza PCr v období zotavení po cvičení je totiž závislá výhradně na oxidativní syntéze ATP, a proto se τPCr považuje za ukazatel kapacity oxidativní fosforylace . Celkově tyto výsledky naznačují, že progresivní redukce RyR1 je spojena s progresivní ztrátou hmotnosti a poklesem svalové síly.

Fyziologické vlastnosti izolovaných vláken jsou u myší RyR1-Rec zhoršeny

Změna svalové funkce byla dále charakterizována na úrovni jednotlivých svalových vláken pomocí kombinace celobuněčné napěťové svorky a konfokálního zobrazování . Síť T-tubulů byla zobrazena pomocí barvení plazmatické membrány di-8-anepps. Nebyl pozorován žádný kvalitativní rozdíl v síti (obr. 3a, vlevo) ani kvantitativní rozdíl v průměrné hustotě T-tubulů mezi vlákny CTRL a RyR1-Rec, kromě mírného, ale významného zkrácení průměrné klidové délky sarkomer (obr. 3a, grafy vpravo). Současně byl hodnocen napěťově aktivovaný influx Ca2+ přes DHPR (obr. 3b-d) a tok uvolňování Ca2+ přes RyR1 (obr. 3e-i). Ve srovnání s vlákny CTRL vykazovala vlákna RyR1-Rec napěťově aktivované Ca2+ proudy DHPR s podobným časovým průběhem (obr. 3b), ale se sníženou hustotou, jak ukazuje závislost maximální proudové hustoty na napětí u obou skupin (obr. 3c), což se projevilo 30% snížením maximální vodivosti (Gmax) bez související změny ostatních parametrů závislosti proudu na napětí (obr. 3d). Závislost uvolňování Ca2+ ze SR na napětí byla hodnocena na základě liniového snímání barviva rhod-2 citlivého na Ca2+. Line-scan snímky z vláken RyR1-Rec byly kvalitativně podobné snímkům z vláken CTRL (obr. 3e) a ukazovaly rychlý nárůst fluorescence při depolarizaci membrány T-tubulu, prostorově homogenní podél snímané linie. Rychlost uvolňování SR Ca2+ (obr. 3g), vypočtená ze změn fluorescence rhod-2 vyvolaných depolarizačními pulzy se zvyšující se amplitudou (obr. 3f), vykazovala u vláken RyR1-Rec podobný časový průběh jako u vláken CTRL, ale co je důležité, vrcholové hodnoty byly u RyR1-Rec sníženy. Fitování vrcholové rychlosti uvolňování SR Ca2+ v závislosti na napětí (obr. 3h-vrchní graf) ukázalo, že maximální rychlost uvolňování Ca2+ byla ve skupině RyR1-Rec snížena o 25 % (obr. 3i, Max), faktor sklonu (k) byl také mírně, ale významně snížen, zatímco napětí střední aktivace (V0,5) se nezměnilo. U vláken RyR1-Rec bylo pozorováno mírné (v průměru 1,3 ms), ale významné prodloužení doby do vrcholu uvolňování SR Ca2+ (obr. 3h, dolní graf). Nebyly pozorovány žádné změny ve schopnosti vláken odstraňovat cytosolický Ca2+ (funkce pumpy SERCA), měřené pomocí nízkoafinitního barviva fluo-4 FF citlivého na Ca2+ v podmínkách bez pufru EGTA (Additional file 1: Fig. S3). Celkově tyto výsledky ukazují, že 35% snížení množství RyR1 v interosseu je spojeno s 30% snížením vápníkového proudu přes DHPR a 25% snížením toku vápníku přes RyR1.

Snížení RyR1 ovlivňuje strukturu kosterního svalu

Pro lepší pochopení podstaty těchto funkčních změn spojených se snížením RyR1 byla studována struktura svalu na RyR1-Rec zvířatech v D75 po rekombinaci a porovnána s CTRL zvířaty. Extensor digitorum longus (EDL), sval s rychlým záškubem, soleus, sval s pomalým záškubem, a tibialis anterior (TA), smíšený sval, byly analyzovány pomocí barvení hematoxylin-eosinem, NADH a Gomoriho trichromem. Barvení TA, uvedená na obr. 4a, ukazují abnormální strukturu svalu u zvířat RyR1-Rec, bez fibrózy nebo centrálních jader, ale s atrofií vláken, postihující jak vlákna typu I, tak vlákna typu II (tab. 2). Dezorganizace mitochondrií charakterizovaná lokální akumulací/deplecí v přilehlých oblastech téhož vlákna (hrot šipky a vložený obr. 4a) a akumulace červeného barvení pozorovaná pomocí Gomoriho trichromu (Additional file 1: Fig. S4), které se podobají prachovým jádrům nedávno popsaným u pacientů. Atrofie vláken byla pozorována u obou typů vláken v EDL, i když redukce byla o něco významnější u vláken typu I (tab. 2). Transverzální řez TA myší CTRL a RyR1-Rec byl obarven protilátkami proti RyR1 a desminu. V řezech RyR1-Rec TA nebyla pozorována žádná změna v distribuci RyR1 mezi vlákny typu I a typu II, což svědčí o podobné redukci RyR1 ve všech typech vláken (obr. 4b). Překvapivě byla pozorována významná modifikace v distribuci desminu s obrovským nárůstem u malých vláken typu I (obr. 4b): v řezech CTRL TA vykazovala všechna vlákna podobné periferní zbarvení, zatímco malá vlákna typu I v řezech RyR1-Rec TA byla silně zbarvena jak na periferii vláken, tak v cytosolu (vložený obr. 4b). Přestože značení IF není kvantitativní, tyto výsledky ukazují, že redukce RyR1 byla s největší pravděpodobností homogenní, bez velkých rozdílů mezi sousedními vlákny, jak bylo pozorováno u desminu, přičemž kvantifikace provedená pomocí Western blotu odráží protein obsažený v každém vlákně, a nikoli průměr vláken s 0 % RyR1 a vláken se 100 % RyR1 v rámci jednoho svalu.

Organizace triád byla dále studována pomocí imunofluorescenčního značení izolovaných vláken EDL (obr. 5a). Značení alfa-aktininu (jako markeru linie Z), triadinu a RyR1 (jako markerů triád) na vláknech RyR1-Rec EDL prokázalo, že snížení množství RyR1 vedlo ke generalizované dezorganizaci vlákna s abnormální lokalizací triád a narušením linie Z, ale triadin a RyR1 byly stále částečně kolokalizovány. Ačkoli triády zůstaly na obou stranách linie Z, linie Z netvořila přímku jako u CTRL a místo toho vykazovala mnoho mikrodisrupcí (vložený obr. 5a). Ultrastruktura svalu byla analyzována pomocí elektronové mikroskopie na vláknech RyR1-Rec EDL v D75 (obr. 5b). Některé oblasti měly relativně zachovalou strukturu (obr. 5b, levé vlákno), zatímco některé přilehlé oblasti byly silně dezorganizované, s narušením pravidelné organizace sarkomer, dezorganizací mitochondrií a přítomností četných hromádek membrán (obr. 5b, šipky, zvětšeno ve vložce), dříve nazývaných mnohočetné triády . Morfologické rysy těchto mnohočetných triád ve srovnání s normálními jednoduchými triádami jsou uvedeny v tabulce 3 a další příklady jsou uvedeny v doplňkovém souboru 1: S5. Přesná kvantifikace předpokládané šířky T-tubulů, předpokládané šířky SR a mezimembránového prostoru (T-tubuly/SR) (Additional file 1: Fig. S5) prokázala obrovský nárůst střední velikosti T-tubulů v těchto vícenásobných triádách (dvojnásobný nárůst, dosahující 202 % velikosti T-tubulů v normální triádě), zatímco střední šířka SR se zvětšila jen nepatrně (+ 10 %) a mezimembránový prostor se nezměnil. Tyto výsledky ukazují na generalizovanou strukturální dezorganizaci svalů myší RyR1-Rec spojenou s remodelací membrán.

Snížení RyR1 je spojeno s modifikací množství četných proteinů

Důsledky snížení RyR1 byly studovány na molekulární úrovni pomocí kvantitativního Western blotu na čtyřhlavém svalu CTRL nebo RyR1-.Rec myší (8 zvířat v každé skupině) v D75 po injekci tamoxifenu (obr. 6). Bylo odhadnuto relativní množství četných proteinů, které se přímo nebo nepřímo podílejí na manipulaci s vápníkem, přičemž jako referenční bylo použito celkové množství proteinů stanovené bezbarvým hodnocením . Mezi touto metodou a použitím těžkého řetězce myozinu jako referenčního proteinu nebyl pozorován žádný rozdíl v kvantifikaci RyR1 (srovnání obr. 1, 6). V množství izoformy triadinu T95, proteinu vázajícího vápník CSQ1, Ca2+-ATPázy SERCA, mitochondriální FoF1-ATPázy a alfa 1 podjednotky DHPR nebyly mezi svaly CRTL a RyR1-Rec pozorovány žádné významné změny (obr. 6a, b). Naproti tomu bylo pozorováno zvýšení množství STIM1 (× 3,7 ± 1, p = 0,02), izoformy triadinu T51 (× 1,6 ± 0,1, p < 0,001), CLIMP63 (× 1,8 ± 0,2, p = 0,004) a ORAI1 (× 3,7 ± 1, p = 0,017). Protože byla pozorována modifikace lokalizace strukturního proteinu desminu pomocí imunofluorescenčního značení (obr. 5b), byla kvantifikována také hladina exprese desminu a byl pozorován enormní nárůst jeho množství (× 8,2 ± 1,2, p = 0,001). Lokalizace CLIMP63 a STIM1 v RyR1-Rec EDL vláknech byla analyzována pomocí imunofluorescenčního značení a nebyla pozorována žádná významná změna (Additional file 1: Fig. S6). Snížení proteinu RyR1 bylo tedy spojeno se zvýšením různých proteinů podílejících se na regulaci vápníku nebo na architektuře svalu.

Autofagie je změněna v důsledku snížení RyR1

Změna autofagie byla pozorována u některých myopatií . Za účelem identifikace mechanismů vedoucích k atrofii svalů v důsledku redukce RyR1 jsme hledali modifikace toku autofagie ve svalech RyR1-Rec. Množství LC3 II, membránového proteinu autofagozomů, bylo hodnoceno pomocí kvantitativního Western blotu (obr. 7a, b) a bylo pozorováno zvýšení LC3 II (172 % ± 32 %, p = 0,03). Tento nárůst autofagozomů by mohl odrážet buď zvýšení tvorby autofagozomů (v důsledku zvýšení procesu autofagie), nebo snížení jejich fúze s lyzozomy (a tedy inhibici degradace autofagů). Přesná povaha modifikace toku autofagie byla dále analyzována kvantifikací p62, známého proteinu specificky degradovaného prostřednictvím autofagie, jehož množství bylo rovněž významně zvýšeno (obr. 7a, b, 172 % ± 22 %, p = 0,006). Související zvýšení LC3 II a p62 ve svalech RyR1-Rec ve srovnání s kontrolou naznačuje, že snížení RyR1 je tedy spojeno s inhibicí toku autofagie. Kromě toho bylo pozorováno zvýšení aktivace (fosforylace) dvou inhibitorů autofagie, mTOR a proteinu S6 (obr. 7b, c) (zvýšení P-mTOR/mTOR o 174 % ± 17 %, p = 0,01; zvýšení P-S6/S6 o 320 % ± 50 %, p < 0,001). Zvýšení fosforylace těchto dvou inhibitorů autofagie u zvířat RyR1-Rec ve srovnání s kontrolami dále poukazovalo na inhibici autofagie zodpovědnou za svalovou atrofii u zvířat RyR1-Rec.

Biopsie lidských pacientů vykazují podobné defekty, jaké byly pozorovány u myší RyR1-Rec

V nedávné studii na velké kohortě pacientů s recesivní vrozenou myopatií , jsme u více než poloviny pacientů se sníženým množstvím RyR1 identifikovali přítomnost atypických struktur, tzv. prašných jader. Byly pozorovány vícenásobným barvením a od klasického centrálního jádra (dobře ohraničené oblasti bez oxidačního barvení) se liší špatně ohraničenými hranicemi, fokální myofibrilární dezorganizací, červenofialovým ukládáním granulovaného materiálu při barvení Gomoriho trichromem a smíšenou oblastí se sníženou a/nebo zvýšenou enzymatickou aktivitou při oxidačním barvení (Additional file 1: Fig. S7). Tyto strukturální změny odrážejí modifikace pozorované na našem myším modelu (obr. 4 a Additional file 1: Fig. S7). Proto jsme dále porovnávali náš nový myší model a svalové biopsie od pacientů se snížením proteinu RyR1 a „zaprášenými jádry“. Pomocí kvantitativního Western blotu bylo množství proteinů, které byly zřetelně modifikovány v našem myším modelu, odhadnuto také u 5 pacientů s recesivním onemocněním „prašných jader“ (dvě mutace RyR1 vedoucí k redukci proteinu RyR1 – obr. 8a). Jako referenční byly použity kontrolní biopsie různého věku (mezi 3,5 a 64 lety). U všech pacientů bylo pozorováno velké snížení proteinu RyR1 (průměrná hladina exprese 19,8 % ± 2,2 % CTRL, p < 0,001). Kromě toho bylo pozorováno také zvýšení CLIMP63 a desminu. Snížení RyR1 bylo spojeno s významným zvýšením CLIMP 63 (průměrné zvýšení hladiny exprese pětinásobně, 516 % ± 220 %). Kromě toho byla u pacientů ve srovnání s kontrolou drasticky zvýšena také úroveň exprese desminu (průměrné zvýšení úrovně exprese 240násobně, 24 170 % ± 7 635 %). Při použití elektronové mikroskopie k analýze ultrastruktury biopsie pacientů bylo u všech pacientů pozorováno mnoho stohů membrán v dezorganizovaných oblastech (obr. 8c, šipky). Tyto oblasti, podobné hromádkám pozorovaným ve svalu RyR1-Rec (obr. 4b), poukazovaly na společný mechanismus, jak u myší, tak u člověka, vedoucí ke vzniku těchto struktur v důsledku redukce RyR1. S identickými modifikacemi jako u pacientů s nemocí prachového jádra tak tento model představuje vhodný model pro studium patofyziologických mechanismů.

.