Cíle:

1. Rozlišit dvě hlavní kategorie bakterií:
2. Pochopit, jak Gramova barvicí reakce působí na grampozitivní a gramnegativní bakterie na základě biochemických a strukturálních rozdílů jejich buněčných stěn.

Klikněte pro zobrazení animace

Zachycení je pomocná technika používaná v mikroskopických technikách, která slouží ke zvýšení jasnosti mikroskopického obrazu.Barviva a barviva se ve vědecké oblasti hojně používají ke zvýraznění struktury biologických vzorků, buněk, tkání atd.

Nejpoužívanějším postupem barvení v mikrobiologii je Gramovo barvení, které objevil dánský vědec a lékař Hans Christian Joachim Gram v roce 1884. Gramovo barvení je diferenciální barvicí technika, která rozlišuje bakterie na dvě skupiny: grampozitivní a gramnegativní. Postup je založen na schopnosti mikroorganismů zachovat barvu barviv použitých při Gramově barvicí reakci. Gramnegativní bakterie se odbarvují alkoholem a ztrácejí barvu primárního barviva, fialovou. Grampozitivní bakterie se alkoholem neodbarvují a zůstávají fialové. Po kroku dekolorizace se použije protibarvivo, které dekolorizovaným gramnegativním organismům dodá růžovou barvu.

Obrázek: Hans Christian Joachim Gram

Důležitost barvení podle Grama:

Barvení podle Grama je velmi důležitým předběžným krokem při počáteční charakterizaci a klasifikaci bakterií. Je to také klíčový postup při identifikaci bakterií na základě vlastností barvení, který umožňuje zkoumat bakterie pomocí světelného mikroskopu. Bakterie přítomné v neobarveném nátěru jsou při prohlížení světelným mikroskopem neviditelné. Po obarvení lze pozorovat i morfologii a uspořádání bakterií. Kromě toho je to také důležitý krok při screeningu infekčních agens v klinických vzorcích, jako jsou například přímé stěry od pacienta.

Postup barvení podle Grama umožňuje bakteriím zachovat barvu barviva na základě rozdílů v chemických a fyzikálních vlastnostech buněčné stěny.

1. Barvení podle Grama. Grampozitivní bakterie: Barví se tmavě fialově díky tomu, že v buněčné stěně zadržují primární barvivo zvané krystalová violeť.

Příklad: Staphylococcus aureus

Obr.: Grampozitivní bakterie

2. Grampozitivní bakterie. Gramnegativní bakterie: Barví se červeně nebo růžově díky tomu, že zadržují protibarvící barvivo zvané safranin.

Příklad: Escherichia coli

Obr: Gramnegativní bakterie

Morfologie bakterií:

Bakterie jsou velmi malé jednobuněčné mikroorganismy všudypřítomné v přírodě. Jejich velikost je mikrometr (1µm = 10-6 m). Mají buněčné stěny složené z peptidoglykanu a rozmnožují se binárním dělením. Bakterie se liší svými morfologickými znaky.

Nejčastější morfologie jsou:

Coccus (pleurální: koky):

Sférické bakterie; mohou se vyskytovat v párech (diplokoky), ve skupinách po čtyřech (tetrakoky), v hroznovitých shlucích (stafylokoky), v řetízcích (streptokoky) nebo v krychlových uspořádáních po osmi a více (sarkiny).

Například: Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes

Bacillus (pleurální: bacily):

Tyčinkovité bakterie; obvykle se vyskytují jednotlivě, ale příležitostně se mohou vyskytovat v párech (diplo-bacily) nebo řetězcích (streptobacily).

Např: Bacillus cereus, Clostridium tetani

Spirillum (pleurální: Spirilla):

Spirálovité bakterie

Např: Spirillum, Vibrio, Spirochete species.

Některé bakterie mají i jiné tvary, například:

Kokobakterie: Podlouhlý kulovitý nebo vejčitý tvar.

Vláknité: Bacily, které se vyskytují v dlouhých řetízcích nebo vláknech.

Fusiformní: Bacily se zúženými konci.

Obr: Různá bakteriální morfologie

Mechanismus skvrn:

Gram pozitivní buněčná stěna:

Gram pozitivní bakterie mají silnou síťovitou buněčnou stěnu, která je tvořena peptidoglykanem (50-90 % buněčné stěny), který se barví na fialovo. Peptidoglykan je hlavně polysacharid složený ze dvou podjednotek zvaných N-acetylglukosamin a N-acetylmuramová kyselina. Při tvorbě sousedních vrstev peptidoglykanu dochází k jejich vzájemnému propojování krátkými řetězci peptidů pomocí enzymu transpeptidázy, což má za následek tvar a tuhost buněčné stěny. Silná vrstva peptidoglykanu grampozitivních organismů umožňuje těmto organismům zadržovat komplex krystalové fialové a jódu a barví buňky jako fialové.

Kyselina lipoteichová (LTA) je další hlavní složkou buněčné stěny grampozitivních bakterií, která je zabudována do vrstvy peptidoglykanu. Skládá se z teichoových kyselin, což jsou dlouhé řetězce ribitolfosfátu ukotvené v lipidové dvojvrstvě prostřednictvím glyceridu. Působí jako regulátor autolytických enzymů stěny (muramidasy:

Medicínský význam grampozitivní buněčné stěny:

LTA má také antigenní vlastnosti, které stimulují specifické imunitní reakce, když se uvolní z buněčné stěny po smrti buňky. Buněčná smrt je mailnly způsobena lýzou vyvolanou lysozymalní činností, kationtovými peptidy z leukocytů nebo beta-laktamovými antibiotiky.

Gram negativní buněčná stěna:

Gram negativní bakterie mají tenčí vrstvu peptidoglykanu (10 % buněčné stěny) a při odbarvení alkoholovým oplachem ztrácejí komplex krystalové violeti a jódu, ale zachovávají protibarvivo safranin, takže se jeví jako červené nebo růžové. Mají také další vnější membránu, která obsahuje lipidy a která je od buněčné stěny oddělena pomocí periplazmatického prostoru.

Medicínský význam gramnegativní buněčné stěny:

Buněčná stěna gramnegativních bakterií je často faktorem virulence, který umožňuje patogenním bakteriím vyvolat onemocnění. Virulence gramnegativních bakterií je často spojena s určitými složkami buněčné stěny, zejména s lipopolysacharidem ( jinak známým jako LPS nebo endotoxin). U lidí vyvolává LPS vrozenou imunitní odpověď charakterizovanou produkcí cytokinů a aktivací imunitního systému. V důsledku produkce cytokinů dochází k zánětu, který může rovněž vyvolat toxicitu pro hostitele.

Stainová reakce:

Čtyři základní kroky Gramova barvení jsou:

1) Aplikace primárního barviva krystalové violeti (CV) na tepelně fixovaný nátěr bakteriální kultury.

CV disociuje ve vodných roztocích na ionty CV+ a Cl -. Tyto dva ionty pak pronikají buněčnou stěnou a buněčnou membránou grampozitivních i gramnegativních buněk. Ionty CV+ později interagují se záporně nabitými bakteriálními složkami a zbarvují bakteriální buňky do fialova.

2) Přídavek Gramova jódu.

Jód (I – nebo I3 -) působí jako mořidlo a jako záchytné činidlo. Mořidlo je látka, která zvyšuje afinitu buněčné stěny k barvivu tím, že se váže na primární barvivo, a vytváří tak nerozpustný komplex, který se zachytí v buněčné stěně. Při Gramově mořicí reakci tvoří krystalová violeť a jód nerozpustný komplex (CV-I), který slouží k tomu, aby se nátěr zbarvil do tmavě fialové barvy. V této fázi se všechny buňky zbarví do fialova.

3) Odbarvení 95% ethylalkoholem.

Alkohol nebo aceton rozpouští lipidovou vnější membránu gramnegativních bakterií, čímž zůstává obnažena peptidoglykanová vrstva a zvyšuje se pórovitost buněčné stěny. Komplex CV-I se pak z tenké peptidoglykanové vrstvy odplaví a zanechá gramnegativní bakterie bezbarvé.

Na druhé straně má alkohol dehydratační účinek na buněčné stěny grampozitivních bakterií, což způsobí zmenšení pórů buněčné stěny. Komplex CV-I se pevně naváže do vícevrstevné, vysoce zesíťované grampozitivní buněčné stěny, čímž se buňky zbarví do fialova.

Krok odbarvení musí být proveden opatrně, jinak může dojít k nadměrnému odbarvení. Tento krok je kritický a musí být správně načasován, jinak dojde k odstranění barviva krystalové violeti z Grampozitivních buněk. Pokud se odbarvovací činidlo aplikuje na buňku příliš dlouho , grampozitivní organismy se budou jevit jako gramnegativní. K nedostatečnému odbarvení dochází, když se alkohol nenechá působit dostatečně dlouho, aby se z gramnegativních buněk vyplavil komplex CV-I, v důsledku čehož se gramnegativní bakterie jeví jako grampozitivní.

4) Kontrabarvení safraninem

Odbarvené gramnegativní buňky lze zviditelnit vhodným kontrabarvivem, kterým je obvykle kladně nabitý safranin, který je obarví na růžovo. Růžové zbarvení, které ulpívá na grampozitivních bakteriích, je maskováno fialovou barvou krystalové violeti (ve výjimečných situacích se někdy místo safraninu používá základní fuschin)

.