1. Popište typy chemických vazeb a sil dvojité šroubovice DNA.
Dvojitá šroubovice DNA má dva typy vazeb, kovalentní a vodíkové. Kovalentní vazby existují uvnitř každého lineárního vlákna a pevně spojují báze, cukry a fosfátové skupiny (jak uvnitř jednotlivých složek, tak mezi složkami). Vodíkové vazby existují mezi dvěma vlákny a tvoří se mezi bází z jednoho vlákna a bází z druhého vlákna při komplementárním párování. Tyto vodíkové vazby jsou jednotlivě slabé, ale dohromady poměrně silné.
2. Vysvětlete, co znamenají pojmy konzervativní a semikonzervativní replikace.
3. Co se rozumí pod pojmem primer a proč jsou primery nezbytné pro replikaci DNA?
Primer je krátký úsek RNA, který je syntetizován primázou za použití DNAjako předlohy během replikace DNA. Po syntéze primeru pak DNA polymeráza přidá DNA na 3′ konec RNA. Primery jsou nutné, protože hlavní DNA polymeráza katalyzující replikaci DNA není schopna zahájit syntézu DNA a vyžaduje spíše 3′ konec. RNA je následně odstraněna anahrazena DNA, takže ve výsledném produktu nejsou žádné mezery.
4. Co jsou to helikázy a topoizomerázy?
5. Co je to DNA? Proč je syntéza DNA na jednom vlákně kontinuální a na opačném vlákně diskontinuální?
Protože DNA polymeráza je schopna přidávat nové nukleotidy pouze na 3´konec vlákna DNA a protože obě vlákna jsou antiparalelní, musí se replikace každé konkrétní oblasti DNA účastnit nejméně dvě molekuly DNA polymerázy. Když se oblast stane jednovláknovou, mají obě vlákna opačnou orientaci. Představte si jednořetězcovou oblast, která vede zleva doprava. Na levém konci směřuje 3′ konec jednoho vlákna doprava a syntéza může začít a pokračovat směrem k pravému konci této oblasti. Druhé vlákno má 5′ konec směřující doprava a syntéza nemůže začít a pokračovat směrem k pravému konci jednořetězcové oblasti na 5′ konci. Místo toho musí syntéza začít někde napravo od levého konce jednořetězcové oblasti a pokračovat směrem k levému konci oblasti. Jak první vlákno pokračuje v syntéze (kontinuální syntéza), jednořetězcová oblast se rozšiřuje směrem doprava. Tím nyní zůstává druhé vlákno v této nové jednořetězcové oblasti nereplikované a musí dojít k druhé iniciaci syntézy DNA, která se pohybuje od současného pravého konce jednořetězcové oblasti směrem k prvnímu iniciačnímu bodu na tomto vlákně. To má za následek přerušení syntézy podél tohoto vlákna.
6. Jestliže thymin tvoří 15 procent bází v určité molekule DNA, kolik procent bází tvoří cytosin?
7. Jestliže obsah GC v molekule DNA je 48 procent, jaký je procentuální podíl čtyř bází (A, T, G a C) v této molekule?
Frekvence A i T je (52 %) = 26 %.
8. Chromozomy E. coli, v nichž je každý atom dusíku značený (to znamená, že každý atom dusíku je těžký izotop 15N místo běžného izotopu 14N), se mohou replikovat v prostředí, v němž je všechen dusík 14N. Pomocí plné čáry znázorňující těžký polynukleotidový řetězec a čárkované čáry pro lehký řetězec nakreslete následující:
a.
Těžký rodičovský chromozom a produkty první replikacepo přenosu do prostředí s obsahem 14N za předpokladu, že chromozom je jedna dvojitá šroubovice DNA a že replikace je semikonzervativní.
b.
Zopakujte část a, ale předpokládejte, že replikace je konzervativní.
c.
Zopakujte část a, ale předpokládejte, že chromozom jsou ve skutečnosti dvě vedle sebe ležící dvojité šroubovice, z nichž každá se replikuje semikonzervativně.
d.
Zopakujte část c, ale předpokládejte, že každá vedle sebe stojící dvojitá šroubovice se replikujekonzervativně a že celková replikace chromozomu je semikonzervativní.
e.
Zopakujte část d, ale předpokládejte, že celková replikace chromozomu jekonzervativní.
f.
Pokud se dceřiné chromozomy z prvního dělení v 14N roztočí v hustotním gradientu chloridu cesného (CsCl) a získá se jediný pás, kterou z možností v částech a až e lze vyloučit?Zopakujte si Meselsonův-Stahlův experiment: co dokazuje?
9. Jaký je výsledek? R. Okazaki zjistil, že bezprostřední produkty replikace DNA v E.coli zahrnují jednořetězcové fragmenty DNA o délce přibližně 1000nukleotidů poté, co je nově syntetizovaná DNA extrahována a denaturována(roztavena). Když nechal replikaci DNA probíhat delší dobu, zjistil nižší frekvenci těchto krátkých fragmentů a dlouhých jednovláknových řetězců DNA po extrakci a denaturaci. Vysvětlete, jak by tentovýsledek mohl souviset se skutečností, že všechny známé DNA polymerázy syntetizujíDNA pouze ve směru 5′ → 3′.
Výsledky naznačují, že DNA je replikována v krátkých úsecích, které jsou následně spojovány enzymatickým působením (DNA ligáza). Protože replikace DNA je obousměrná, protože podél DNA existuje více bodů, kde je replikace zahájena, a protože DNA polymerázy pracují pouze ve směru 5′ → 3′, je jedno vlákno DNA vždy v nesprávné orientaci pro enzym. Tovyžaduje syntézu po fragmentech.
10. Když jsou rostlinným a živočišným buňkám podávány pulzy thymidinu vrůzných obdobích buněčného cyklu, vždy se ukáže, že heterochromatické oblasti nachromozomech jsou „pozdně replikující“. Můžete navrhnout, jaký, pokud vůbec nějaký, biologický význam by toto pozorování mohlo mít?
11. Na planetě Rama je DNA tvořena šesti typy nukleotidů: A, B, C, D, E a F. A a B se nazývají marziny, C a D areziny a E a F jsou piriny. Pro všechny Ramovy DNA platí následující pravidla:
a.
Připravte model struktury Ramovy DNA.
b.
Na Ramu vznikají při mitóze tři dceřiné buňky. S ohledem na tuto skutečnost navrhněte pro svůj model DNA vzorec replikace.
c.
Přemýšlejte o procesu meiózy na Rámě. Jaké připomínky nebo závěry můžete navrhnout?
12. Jaký je váš názor? Pokud extrahujete DNA kolifága øX174, zjistíte, že její složeníje 25 % A, 33 % T, 24 % G a 18 % C. Dává toto složení smysl s ohledem na Chargaffova pravidla? Jak byste tento výsledek interpretovali? Jak by takový fág mohl replikovat svou DNA?
Chargaffova pravidla říkají, že A = T a G = C. Protože toto složení není pozorováno, nejpravděpodobnější interpretace je, že DNA je jednovláknová. Fág by musel nejprve syntetizovat komplementární vlákno, než by mohlzačít vytvářet více kopií sebe sama.
13. Co je to DNA? Teplota, při které vzorek DNA denaturuje, může být použita k odhadu podílu jejích nukleotidových párů, které jsou G-C. Co by bylo základem pro totourčení a co by naznačovala vysoká teplota denaturace vzorku DNA?
Pamatujte, že mezi A a T jsou dvě vodíkové vazby, zatímco mezi G a C jsou tři vodíkové vazby. Denaturace vyžaduje přerušení těchto vazeb, což vyžaduje energii. Čím více vazeb je třeba přerušit, tím více energie je třeba dodat. Teplota, při které daná molekula DNA denaturuje, je tedy funkcí jejího složení bází. Čím vyšší je teplota denaturace, tím vyšší je procento párů G-C.
14. Předpokládejme, že extrahujete DNA z malého viru, denaturujete ji a necháte jireagovat s DNA odebranou z jiných kmenů, které nesou buď deleci, aninverzi, nebo duplikaci. Co byste očekávali, že uvidíte při prohlídce elektronovým mikroskopem?
15. Jaký je výsledek? DNA extrahovaná ze savce je tepelně denaturována a poté pomalu ochlazována, aby se umožnilo její žíhání. Následující graf ukazuje získané výsledky. Jedná se o dvě „ramena“ na křivce. První rameno naznačuje přítomnost velmirychle žíhající části DNA – ve skutečnosti tak rychle, že k žíhání dochází dříve, než dojde k interakci vláken.
a.
Co by to mohlo být za část DNA?
b.
Druhé rameno je rovněž rychle žíhající část. Co z tohoto důkazu vyplývá?
16. Navrhněte testy k určení fyzikálního vztahu mezi vysoce repetitivními ajedinečnými sekvencemi DNA v chromozomech. (Nápověda: Velikost molekul DNA je možné měnit velikostí střihu, kterému jsou vystaveny.)
17. Zjistěte, zda se v chromozomech vyskytují různé sekvence DNA. Je známo, že viry způsobují rakovinu u myší. Máte k dispozici čistý preparát virovéDNA, čistý preparát DNA z chromozomů myších rakovinných buněk ačistou DNA z chromozomů normálních myších buněk. Virová DNA se specificky spojí s DNA rakovinných buněk, ale ne s DNA normálních buněk. Prozkoumejte možnýlegenetický význam tohoto pozorování, jeho význam na molekulární úrovni a jeho medicínský význam.
18. Ruth Kavenaugh a Bruno Zimm navrhli techniku měření maximální délky nejdelších molekul DNA v roztoku. Studovali vzorky DNA zetří karyotypů drozofily zobrazených vpravo. Zjistili, že nejdelší molekuly u karyotypů a a b mají podobnou délku a jsou přibližně dvakrát delší než nejdelší molekuly u karyotypu c. Interpretujte tyto výsledky.
Údaje naznačují, že každý chromozom je tvořen jednou souvislou molekulouDNA a že translokace mohou měnit jejich velikost. V části c se zdá, žečást nejdelšího chromozomu byla přemístěna na nejkratšíchromozom.
19. Jaké jsou výsledky? Při technice harlekýnových chromozomů necháte proběhnout tři kola replikace v bromodeoxyuridinu a poté chromozomy obarvíte. Jaký výsledek očekáváte?
.